【实验目的】

（1）掌握重组DNA连接方法、酶切及连接原理。

（2）熟悉酶切反应、连接、实验条件。

（3）了解各种内切酶的作用靶点。

【实验原理】

限制性内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，功能类似高等动物免疫系统，用于抗击外来DNA侵袭。以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH。DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内，或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。限制性内切酶分为Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类。Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4～6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列：5′- G↓AATTC-3′），有少数酶识别更长的序列或简并序列。

限制性内切酶特点：Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA段（如SmaⅠ：5′-CCC↓GGG-3′）；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA段称粘性末端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的黏性末端：

5′…G↓AATTC…3′→5′… G AATTC…3′

3′…CTTAA↑G …5′→3′… CTTAA G…5′

影响限制性内切酶的因素：DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3 mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70 °C低温冰箱30 min，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。

【实验试剂与器材】

1. 实验材料

λDNA，重组pBS质粒或pUC19质粒。

2. 实验试剂

（1）EcoRI酶及其酶切缓冲液。

（2）HindⅢ酶及其酶切缓冲液。

（3）琼脂糖（Agarose）。

（4）5×TBE电泳缓冲液。

（5）6×电泳载样缓冲液。(www.daowen.com)

【实验步骤】

（1）将清洁干燥并经灭菌的Eppendorf管（最好0.5 mL）编号，用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2 μL，再加入重蒸水使总体积为19 μL。

（2）将管内溶液混匀后加入1 μL酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。

（3）混匀反应体系后，将Eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37 °C水浴保温2～3 h，使酶切反应完全。

（4）每管加入2 μL 0.1mol/L EDTA（pH8.0），混匀，以停止反应，置于冰箱中保存备用。

【注意事项】

（1）限制性内切酶的用量根据内切酶单位和DNA用量而定，通常 1U指在适当条件下，1 h内完全酶解1 μg特定DNA底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以1 μg DNA对2～3U酶，短时间为宜。

（2）限制性内切酶体积不能超过反应体系10%，因内切酶中含50%甘油，体系中甘油超过5%会抑制内切酶活力。

（3）不应混有其他杂蛋白，特别是其他内切酶或外切酶的污染。

（4）吸样量一定要准确。

（5）加样按体积从大到小，最后加酶。

（6）要求在冰上操作，并充分混匀。

（7）开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。

（8）样品在37 °C与65 °C保温时，需盖严离心管，以防水进入管内造成实验失败。

【讨论与思考】

（1）酶切片断的回收与连接时有哪些注意事项？

（2）限制性内切酶为什么要尽量避免反复冻融？该如何处理？