【实验目的】

（1）掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方法。

（2）熟悉琼脂糖凝胶电泳仪器的使用。

（3）了解实验不同结果原因及分析。

【实验原理】

琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用。它首先利用琼脂糖的分子筛效应；此外，在弱碱性条件下，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同，它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭（EB）能与双链DNA结合的作用，利用EB染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。琼脂糖凝胶电泳技术（Agarose gel electrophoresis）是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度，并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辨0.1～6.0 kb的双链DNA片段。

【实验试剂与器材】

1. 实验试剂

（1）琼脂糖。

（2）10×TAE电泳缓冲液。

（3）上样缓冲溶液（0.25%溴酚蓝，30%甘油）。

（4）三羟甲基氨基甲烷（Tris）、硼酸、乙二胺四乙酸（EDTA）。

（5）核酸染料。

（6）DNA marker。

2. 实验器材

琼脂糖凝胶电泳系统，凝胶成像系统。

【实验步骤】

（1）取琼脂糖0.9 g，加入100 mL 1×TAE电泳缓冲液于250 mL烧瓶中，100 °C加热溶解。(www.daowen.com)

（2）平衡凝胶槽，放好两侧挡板，调节好梳子与底板的距离（一般高出底板0.5～1 mm）。

（3）铺板：在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5 μg/mL的溴化乙锭水溶液，轻轻混匀，待冷至50 °C左右倒入凝胶槽，胶的厚度一般为5～8 mm。

（4）待胶彻底凝固后，去掉两侧挡板，将凝胶放入盛有电泳液的槽中（加样孔朝向负极端，DNA由负极向正极移动），使液面高出凝胶2～3 mm，小心拔出梳子。

（5）DNA样品与载体缓冲液5∶1混合并加入凹孔中（样品不可溢出）。

（6）打开电源，调节所需电压，电压与凝胶的长度有关，一般使用电压不超过5 V/cm。

（7）据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止（溴酚蓝的涌动距离在5sRNA和0.3 kb DNA带之间）。

（8）电泳完毕关闭电源。将凝胶放紫外灯下观察并拍照，电泳检测分析结果如图9-2所示。

图9-2　琼脂糖凝胶电泳检测分析结果

【注意事项】

（1）在使用Golden View等核酸荧光染料时，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。

（2）一般来说低浓度、低电压下，分离效果较好。线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5 V/cm。

（3）温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在4 °C，进行电泳。

【讨论与思考】

（1）何为电泳？影响泳动速率的因素有哪些？

（2）简述核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系。