【实验目的】

（1）掌握质粒提取的原理和方法测定的应用。

（2）熟悉碱裂法提取质粒的基本操作步骤。

（3）了解质粒小抽提取试剂盒的组成和实验原理。

【实验原理】

质粒是细菌染色体外能自身独立复制的双股环状DNA，带有遗传信息，可赋予细菌某些新的表型。将质粒指纹图谱分析方法、质粒 DNA探针技术及检测质粒的PCR技术用于临床感染性疾病的诊断和流行病学调查已成为现实。质粒作为载体在基因工程中起着重要的作用。分离和纯化质粒DNA的方法很多，但这些方法基本包括3个步骤：即细菌的培养和质粒DNA的扩增；细菌菌体的裂解；质粒DNA的提取与纯化。

本实验学习用碱变性方法提取质粒DNA。细菌培养物加入SDS和NaOH碱性溶液处理后，菌体裂解，可使细菌的质粒DNA、染色体DNA和RNA一起从细胞内释放出来，经琼脂糖凝胶电泳，因各种核酸分子的迁移率不同将上述核酸分成不同的带。用核酸染料（Gold view）染色后，在紫外线灯下可看到各种核酸带发出的荧光。根据荧光的位置，可区分不同的核酸带。

【实验试剂与器材】

1. 实验材料

菌种（E.coli DH5α大肠杆菌，含Kana抗性的质粒pEGFP-N1）。

2. 实验试剂

（1）溶液Ⅰ（50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris.Hcl pH8.0，10 mmol/L EDTA）。

（2）溶液Ⅱ（0.2 mmol/L NaOH，1%SDS）用前新配制。

（3）溶液Ⅲ（5 mmol/L KAc溶液，pH4.8）。

（4）TE缓冲液（10 mmol/L Tris.Hcl，1 mmol/L EDTA，pH8.0）。

（5）LB液体培养基（胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，加蒸馏水溶解，用NaOH调pH至7.5，加水至1 000 mL，121 °C灭菌20 min）。

（6）RNA酶。

（7）饱和酚，氯仿，异戊醇。

（8）TAE缓冲液。

（9）上样缓冲液。(www.daowen.com)

3. 实验器材

恒温振荡培养仪、高速冷冻离心机、漩涡振荡仪、各种规格的移液枪及枪头、分析天平、灭菌锅、1.5 mL/10 mL离心管、试管及试管塞、琼脂糖凝胶电泳仪等。

【实验步骤】

（1）接种细菌于5 mL LB液体培养基中，37 °C培养过夜。

（2）以3 000 r/min离心15 min，弃上清。加入100 μL溶液Ⅰ悬起细菌沉淀。

（3）加入200 μL前新配制的溶液II，颠倒EP管5次混合均匀，冰浴2 min。

（4）加入150 μL溶液III温和地混匀，以12 000 r/min离心5 min。

（5）吸取上清清亮裂解液放入另一新EP管中，加等体积酚-氯仿-异戊醇抽提2次，以12 000 r/min离心2 min。（若不做酶切，此步可省略）吸取上清放入另一新EP管中，加入2倍体积的冷乙醇，以12 000 r/min离心10 min。

（6）弃乙醇，干燥后用30 μL TE缓冲液洗下核酸，待电泳检测。

【注意事项】

（1）对于低拷贝数的质粒，请用5 mL细胞。

（2）步骤（2）和（3）在冰上操作效果更佳。

（3）提高离心速度，使沉淀更加紧密，步骤6操作取上清更为方便。

（4）步骤（6）转移上清时不要吸取沉淀，否则会出现Genomic DNA和蛋白质污染。

（5） 将TE或水预热到50 °C左右可以提高洗脱效率。测序用质粒用30 μL预热的水洗脱，浓度一般满足测序要求。

【讨论与思考】

（1）碱裂法提质粒的原理是什么？

（2）实验过程中所用的试剂的作用各是什么？

（3）载体质粒的选择标准是什么？