【实验目的】

（1）掌握逆RT-PCR的技术和方法。

（2）熟悉实验过程中涉及的主要试剂、主要仪器的操作及注意事项。

（3）了解用RT-PCR获取目的基因的原理。

【实验原理】

逆转录是某些生物的特殊复制方式，是以RNA为模板合成DNA的过程，逆转录PCR正是通过体外模拟该过程，以样本中提取的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补的cDNA，然后利用DNA聚合酶，以cDNA生物第一链为模板，以脱氧核苷三磷酸为材料（dNTP），在引物的引导下，扩增出大量的cDNA。逆转录PCR技术用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平及差异，细胞中病毒RNA的含量等。这里以TaKaRa反转录试剂盒的操作方案为例。

【实验试剂与器材】

1. 实验材料

RNA样品。

2. 实验试剂

TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）。

3. 实验器材

移液枪、PCR管、PCR仪、电泳仪等。

【实验步骤】

（1）在PCR管中配置如表9-2所示反应体系。(www.daowen.com)

表9-2

（2）进行RT-PCR反应：50 °C，30 min（逆转录）→94 °C，3 min（逆转录酶失活）→（94 °C，30 s→60 °C，30 s→72 °C，1～10 min）30（PCR扩增），如图9-1所示。

图9-1　PCR仪设定RT-PCR反应程序

（3）取10 μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析，剩余的PCR产物保存在-20 °C，以备以后分析使用。

【注意事项】

（1）逆转录过程中建立 Rnase-free环境，避免RNA的降解。

（2）操作全程佩戴手套。

【讨论与思考】

（1）RT-PCR实验的模板是什么？

（2）简述逆转录PCR的实验流程。

（3）RT-PCR实验的注意事项有哪些？