【实验目的】

（1）掌握PCR反应的基本原理与实验技术。

（2）熟悉PCR仪的使用与常见问题的处理方法。

（3）了解PCR技术的相关类型和在医学诊断方面的应用。

【实验原理】

PCR技术，即聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。

PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成：① 模板DNA的变性：模板DNA经加热至94 °C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；② 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55 °C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③ 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性—退火—延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4 min，2～3 h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

【实验试剂与器材】

1. 实验材料

待鉴定的小提质粒，引物。

2. 实验试剂

（1）TAE电泳缓冲液。

（2）10×PCR缓冲液。

（3）4种dNTP混合液。

（4）DNA聚合酶。

（5）引物（20 μmol/L）。

（6）10×溴酚蓝上样缓冲液。(www.daowen.com)

3. 实验器材

PCR仪、微型水平电泳槽、电泳仪、水浴锅、离心机等。

【实验步骤】

（1）在0.2 mL Eppendorf管内，按表9-1配方配制20μL反应体系。

表9-1

（2）设计循环程序，进行扩增。94 °C，5 min，1个循环；94 °C，30 s，52 °C（退火温度根据实验设定），30 s，72 °C，30 s（延伸时间根据实验设定），30个循环；72 °C延伸10 min；4 °C保温。

（3）扩增结束后取20 μL扩增产物，利用琼脂糖电泳检测DNA扩增情况，并切胶用于回收。

【注意事项】

（1）PCR体系的配制过程中应尽量减少污染的机会，以免出现目的条带以外的杂带。

（2）加样时要认真，吸头垂直进入试剂管，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。

（3）Taq聚合酶（置于冰盒上）应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头深入不可过深，酶量不能过多。

【讨论与思考】

（1）核酸染料染色的原理是什么？

（2）PCR未观察到重组条带都有哪些原因？

（3）临床上哪些指标检测需要用到PCR技术，试举1～2例加以说明？