目的基因与载体结合，这是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心，目的是使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。

DNA重组载体是指能够插入外源性DNA序列，并进行自主复制的一段DNA序列。基因工程中作为载体使用的DNA分子必须具备以下基本条件： 能自主复制，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制；② 具有一种或多种限制性内切酶的单一切割位点，并在位点中插入外源基因后，不影响其复制功能；③ 具有1～2个筛选标记，以便重组后进行重组子的筛选；④ 克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并不会任意转入其他生物细胞；⑤ 易于操作，转化效率高。常用的基因载体有质粒、噬菌体DNA、病毒和酵母人工染色体。

（一）质粒及其特性

质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌基因组DNA之外，具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。在基因工程中质粒常被用作目的基因的载体（vector）。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA同步复制。质粒DNA分子上有特殊的标记基因，如四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因等标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子（简称cccDNA）。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌拟核DNA的0.5%～3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下（少数质粒的相对分子质量介于两者之间）。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10～200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。

大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的叶绿体和线粒体等胞器中。然而，1984年，在Streptomyces coelicoler（天蓝色链霉菌）等放线菌以及在Borrelia hermsii（赫氏蜱疏螺旋体）等原核生物中，又相继发现线形质粒。

（二）质粒的种类

质粒根据它们所带有的基因及其宿主细胞的特点可以分为6种不同的类型：

1. 抗性质粒

它们带有抗性基因，可使宿主菌对某些抗生素产生抗性，如对氨基苄青霉素，氯霉素等产生抗性。不同的细菌中也可含有相同的抗性质粒，如RP4质粒在假单胞菌属和其他细菌中都存在。R质粒还可以通过感染的形式在不同种的细菌中传播。

2. 致育因子

可以通过接合在供体和受体间传递遗传物质。F因子约有1/3的DNA构成一个转移DNA的操纵子，约35个基因，负责合成和装配性伞毛。这就是DNA转移区域，受traJ基因产物的正调节。它还具有重组区和复制区。重组区含有多个插入顺序，通过这些插入顺序进行同源重组。在复制区有两个复制起始点：一个是OriV，供给F因子在宿主中自主复制时使用;另一个是OriT，供接合时进行滚环复制的起始点。

3. Col质粒

带有编码大肠杆菌素的基因，大肠杆菌素可杀死其他细菌。

4. 降解质粒

降解质粒可编码一种特殊蛋白，可使宿主菌代谢特殊的分子，如甲苯或水杨酸。

5. 侵入性质粒

侵入性质粒使宿主菌具有致病的能力，如Ti质粒，这是在根癌农杆菌中发现的，现经过加工用来作植物转基因的一种常用载体。

6. 隐秘质粒(www.daowen.com)

隐秘质粒不显示任何表现类型，主要通过物理方法才能发现，如酵母菌2微米质粒。

（三）重组质粒的构建

1. 质粒载体

细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。其自我复制能力及所携带的遗传信息在重组DNA操作，如扩增、筛选过程中都是极为有用的。

质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松弛控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有两个以上的遗传标记物，便于鉴定和筛选。（5）对宿主细胞无害。常用的质粒载体大小一般在1 kb～10 kb，如PBR322、PUC系列、PGEM系列、PET系列和pBluescript（简称pBS）等。

利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争。在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性（Incompatibility）。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。质粒通常含有编码某些酶的基因，其表型包括对抗生素的抗性，产生某些抗生素，降解复杂有机物，产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。

2. 质粒提取

从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA（Covalently closed circularDNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其他形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子，称开环DNA（Open circularDNA，简称ocDNA）；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA（LinearDNA）。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度。

3. 酶切与链接

在DNA连接酶的作用下，在Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同黏性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比黏性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物；然后酶-AMP复合物再结合到具有5′ 磷酸基和3′ 羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。DNA重组的方法主要有黏端连接法和平端连接法，为防止载体本身的自连，可以通过CIP（牛小肠碱性磷酸酶）处理克服。

连接反应的温度在37°C时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，黏性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12～16 °C，连接12～16 h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

4. 转 化

转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-）。它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法，如电击法、CaCl2、RbCl（KCl）等化学试剂法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl（KCl）法。RbCl（KCl）法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油，于-70 °C保存（保存时间为半年左右），因此CaCl2法使用更为广泛。

5. 重组质粒的筛选

利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法，又称为蓝白斑筛选。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β补半乳糖苷酶的启动子及其α肽链的DNA序列，此结构称为Lac Z′基因。Lac Z′基因编码的α肽链是β-半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β-半乳糖苷酶分子。Lac Z′基因编码的α肽链与失去了正常氨基端的β-半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α互补。由α互补而形成的有功能活性的β补半乳糖苷酶，可以用X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-哚-al半乳糖苷）显色出来，它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带着Lac Z′基因的质粒载体，转化了染色体基因组中存在着此种β-半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的β-半乳糖苷酶，在IPTG（异丙基硫代β异丙基半乳糖苷）诱导后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于Lac Z′中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的β-半乳糖苷酶相互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。

由此可见，重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。