（一）实验原理

PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸3个基本反应步骤构成。

1. 模板DNA的变性

模板DNA经加热至93 °C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便与特异性引物结合，为下轮反应做准备。

2. 模板DNA与引物的退火（复性）

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55 °C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

3. 引物的延伸

DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性—退火—延伸3个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4 min，2～3 min可将待扩目的片段富集106～109倍。所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

PCR的反应动力学：PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升；反应最终的DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期。因PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的等因素存在，大多数情况下平台期的到来是不可避免的。

（二）PCR扩增过程

1. 模板DNA变性

模板DNA就是需要复制的DNA片段，模板DNA加热至93 °C左右一定时间后，连接碱基的氢键在高温断裂，使DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，并成为下步扩增反应的模板。

模板核酸的量与纯化程度，是PCR成功与否的关键环节之一。传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂如酚与氯仿抽提掉蛋白质和其他细胞组分后，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板，用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质，获得游离的靶基因，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

2. 模板DNA与引物的退火（复性）

引物是一小段人工合成的20～30 bp单链DNA或RNA，也是聚合酶链式反应（PCR）中人工合成的复制起始点，每一条引物都与待扩增的靶区域特异互补。PCR反应体系中需加入一对引物。一般在55 °C左右，引物就会和与其序列互补的模板DNA单链配对结合。

引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：

（1）引物长度：15～30 bp，常用为20 bp左右。

（2）引物扩增跨度：以200～500 bp为宜，特定条件下可扩增长至10 kb的片段。

（3）引物碱基：GC%含量以40%～60%为宜，GC%太少扩增效果不佳，GC%过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

（4）避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3′端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

（5）引物3′端的碱基，特别是最末及倒数第2个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

（6）引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切后的片段分析或分子克隆很有好处。

（7）引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。每条引物的浓度0.1～1 μmol或10～100 pmol，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

3. 引物的延伸

DNA模板与引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，根据碱基配对原理，合成一条新的DNA互补链。新合成的DNA链并不是整个DNA链，而是由引物界定的、生物体特异的100 bp～600 bp的靶序列。

Taq DNA聚合酶是一种来源于嗜热水生菌的重组热稳定的DNA聚合酶，与一般的聚合酶所不同的是在高温状态仍具有活性。催化典型PCR反应需酶量约2.5U/100 μL，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP呈颗粒粉状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1 mol/L NaOH或1 mol/L Tris。HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20 °C冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200 μmol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其他几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200 μmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

4. DNA扩增

重复以上变性、退火、延伸三个过程，就可获得更多的DNA链，这一过程中新合成的新链又可成为下次循环的模板，使产物的数量按2n增长。因此，高温变性模板、引物与模板退火、引物沿模板延伸三步反应组成一个循环。从形论上讲，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。

（三）PCR扩增条件

PCR反应需要控制的条件是反应的温度、每个步骤的时间和循环次数。PCR仪在使用前需要对每个反应的温度和时间进行设定。基于PCR原理三步骤而设置变性—退火—延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95 °C变性，再迅速冷却至40～60 °C，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75 °C，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100～300 bp时）可采用二温度点法，除变性温度外，退火与延伸温度可合二为一，一般采用94 °C变性，65 °C左右退火与延伸（此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性）。(www.daowen.com)

1. 变性温度与时间

变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93～94 °C、l min足以使模板DNA变性，若低于93 °C则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。如果靶基因模板或PCR产物不完全变性，将导致PCR失败。

2. 退火（复性）温度与时间

退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40～60 °C，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，GC%含量约50%的引物，最适退火温度选择的起点温度为55 °C。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

（1）Tm值（解链温度）=4(G+C)+2(A+T)

（2）复性温度=Tm值-(5～10 °C)

在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60 s，足以使引物与模板之间完全结合。

3. 延伸温度与时间

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75 °C，常用温度为72 °C，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1 kb以内的DNA片段，延伸时间1 min是足够的。3～4 kb的靶序列需3～4 min；扩增10 kb需延伸至15 min。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

4. 循环次数

循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

（四）PCR反应特点

1. 特异性强

PCR反应的特异性决定因素为引物与模板DNA特异的正确结合、碱基配对原则、TaqDNA聚合酶合成反应的正确度、靶基因的特异性与保守性。

2. 灵敏度高

PCR产物的生成量是以指数方式增加的。

3. 简便快速

PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性、退火、延伸反应，一般在2～4 h完成扩增反应。

4. 对标本的纯度要求低

不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总MA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗漱液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。

（五）几种常用特殊PCR技术

1. 逆转录PCR（Reverse transcription-PCR，RT-PCR）

RT-PCR即逆转录-聚合酶链反应。提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

2. 多重PCR（Multiple PCR）

多重PCR（multiplex PCR），又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。多重PCR具有高效性、系统性、经济简便性等特点。

3. 套式PCR（nested PCR）

套式PCR，又称巢式PCR。是一种变异的聚合酶链反应，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片断短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于：如果第一次扩增产生了错误片断，第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。

4. 不对称PCR（asymmetric PCR）

不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法。不对称PCR制备的单链 DNA在用于序列测定时不必在测序之前除去剩余引物，简化操作、节约人力物力。另外，用cDNA经不对称PCR进行序列分析或PCR-单链构象多态性分析（PCR-single-strand conformation polymorphism，SSCP）分析也是现在研究真核外显子的常用方法。根据实验设计的不同，不对称PCR又可分为引物浓度不对称PCR和热不对称PCR。