【实验原理】

Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA，酸性条件使RNA与DNA分离，加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。

【实验试剂与器材】

1. 材 料

微生物细胞、植物组织、动物组织等。

2. 试 剂

Trizol、氯仿、异丙醇、75%乙醇（用RNase-Free水配制）、RNase-Free水等。

3. 器 材

恒温水浴、冷冻高速离心机、紫外分光光度计、微量移液器、电泳仪、电泳槽等。各规格移液器吸头、1.5 mL EP管（均用DEPC处理）。

【实验步骤】

（1）提取组织RNA时，每50～100 mg组织用1mL Trizol试剂对组织进行裂解。提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5×106～10×106个细胞加1mL Trizol试剂后，反复用枪吹打或剧烈震荡以裂解细胞。

（2）将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中，在室温下（15～30 °C）下放置5 min。

（3）在上述EP管中，按照每1 mL Trizol后加0.2 mL氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15 s，在室温下（15～30 °C）放置2～3 min后，于2～8 °C、12 000 r/min离心15 min。

（4）去上层水相置于新EP管中，按照每1 mL Trizol加0.5 mL异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15～30 °C）放置10 min后，于2～8 °C、12 000 r/min离心10 min。(www.daowen.com)

（5）弃上清，按照每1 mL Trizol加1 mL 75% 乙醇进行洗涤，涡旋混合，于2～8 °C、7 500 r/min离心5 min，弃上清。

（6）让沉淀的RNA在室温下自然干燥。

（7）用Rnase-Free 水溶解RNA沉淀，待用。

【注意事项】

（1）整个操作要戴口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

（2）在收集到生物材料之后，最好能即时进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80 °C冷冻柜。

（3）在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

（4）加氯仿前的匀浆液可在-70°C保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4°C保存一周，-20 °C保存一年。

【讨论与思考】

（1）简述Triozl、氯仿、异戊醇等试剂的作用。

（2）用Trizol试剂盒抽提总RNA时，加入氯仿离心取出的上清液加入异丙醇后，会出现大量絮状白色物质，离心后有大量沉淀，OD260/OD280约为1.5，请分析白色物质及沉淀是什么？导致这种现象的原因是什么？

（3）请了解其他RNA提取的方法，并总结Trizol法抽提RNA的优缺点。