【实验目的】

（1）掌握基因组DNA提取的原理和实验操作细节，掌握酚氯仿抽提法提取外周血DNA的原理和实验操作细节。

（2）熟悉实验动物的取材方法及组织匀浆制备方法，熟悉主要试剂及低温离心机的操作及注意事项。

（3）了解试剂盒提取质粒DNA方法和原理，离心机的分类及其他提取方法。

一、猪肝脏基因组DNA的粗提

【实验原理】

DNA在生物体中常与蛋白质组成核蛋白（DNP/RNP）的形式存在。其中，DNP溶解于水及高浓度的盐溶液，在0.14 mol/L NaCl的低盐溶液中溶解度低。而RNP则在低盐溶液中溶解度较高。因此，利用这一性质可将生物组织中的DNP与RNP分离，并从样品中抽提出来。将抽提出来的DNA用SDS处理，可将DNP分解成DNA和蛋白质，再利用氯仿-异戊醇震荡除蛋白，震荡时蛋白质变性，形成凝胶并与DNA分离，DNA则留在水层中。向获得的DNA上清液中加入乙醇，即可将纤维状DNA沉淀析出。

【实验试剂与器材】

1. 实验材料

新鲜猪肝脏。

2. 实验试剂

（1）5 mol/L NaCl。

（2）0.14 mol/L NaCl-0.15 mol/L EDTA溶液。

（3）25% SDS。

（4）氯仿-异戊醇。

（5）95%乙醇。

3. 实验器材

吸管、移液管、离心管、洗耳球、玻棒、匀浆器、恒温水浴锅、离心机。

【实验步骤】

（1）取新鲜猪肝4 g，用0.14 mol/L NaCl-0.15 mol/L EDTA溶液洗去血液，剪碎。加入10 mL 0.14 mol/L NaCl-0.15 mol/L EDTA溶液，置匀浆器中研磨，此步骤为初步破碎细胞。

（2）取一支10 mL EP管，装入糊状物（基本装满），10 000 r/min离心5 min，除去上清液。沉淀用0.14 mol/L NaCl-0.15 mol/L EDTA溶液洗2次。每次加入溶液后用吸管吹打均匀再离心（同上），直到上清液无血细胞。弃上清液，所得沉淀为DNP（DNA蛋白复合物）粗制品。

（3）向上述沉淀物加入0.14 mol/L NaCl -0.15 mol/L EDTA溶液5 mL，然后每管滴加25%的SDS溶液1 mL，边加边振荡。加毕，置60 °C水浴10 min（不停振荡），直至溶液变得黏稠并略透明，取出冷却至室温，此步使核酸与蛋白质分离。

（4）每管加入5 mol/L NaCl溶液2 mL，蝴蝶形振荡5 min。加入约1倍体积的氯仿-异戊醇混合液，蝴蝶形振荡5 min，4 000 r/min离心10 min。此步后溶液分三个相：上层水相（DNA）、中层变性蛋白质相、下层有机相和残余的RNA。

（5）吸出上清液，除去沉淀。向上清液中缓慢加入1.5～2倍体积的95%乙醇后可见白色丝状物，则为DNA沉淀，再经4 000 r/min，离心5 min制得粗提DNA物。此步为猪肝基因组DNA提取的最后一步。

（6）用0.1 mol/L的NaOH 1 mL，溶解上述DNA沉淀，制备DNA溶液。此步为下次的DNA含量测定做准备。

【注意事项】

（1）匀浆（细胞破碎）要充分，需剪成小块。

（2）变性蛋白质易散，吸取上清液时应仔细，不要将蛋白质及下层的氯仿吸入。

（3）实验结束后将变性蛋白质小心取出置于专用废物袋中，氯仿倒入回收瓶内。

（4）离心机使用前必须将离心管平衡，对称放置。调速必须从低到高，离心结束时等转子完全停下后再打开盖子。

【讨论与思考】

（1）核酸提取中SDS、氯仿-异戊醇各有什么作用？

（2）结合本人操作体会，试述在提取过程中应该注意些什么？如何避免大分子DNA的降解和断裂？

（3）核酸提取过程中，除去杂蛋白的方法主要有哪几种？

二、酚氯仿抽提法提取外周血DNA

【实验原理】(www.daowen.com)

将分散好的真核生物组织、细胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，破坏细胞膜、核膜。SDS可使组织蛋白与DNA分子分离，EDTA能抑制细胞中DNase的活性，使DNA分子完整地以可溶形式存在于溶液中，再用酚、氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质，（氯仿可除去DNA溶液中微量酚的污染，异戊醇还可减少蛋白质变性操作过程中气泡的产生）得到的DNA溶液经乙醇沉淀进一步纯化，为获得高纯度DNA，操作中常加入RNase除去RNA，此法可获得100～200 kb的DNA片段，适用于构建真核基因组文库，Southern Blot分析。

【实验试剂与器材】

1. 实验材料

新鲜外周静脉血。

2. 实验试剂

（1）ACD（柠檬酸钠缓冲液pH 7.2）。

（2）蛋白酶-K（100μg/mL）。

（3）酚、氯仿、异戊醇。

（4）70%乙醇。

（5）醋酸钠（3 mol/L）。

（6）STE（0.1 mol/L NaCl、10 mmol/L Tris pH8.0、1 mmol/L EDTA pH 8.0）。

3. 器 材

离心机、制冰机。

【实验步骤】

（1）新鲜外周静脉血3～5 mL，以1/7体积ACD抗凝，3 500 r/min 离心15 min，吸除上层血浆。

（2）加5倍体积灭菌蒸馏水，摇匀，静置5～10 min，3 500 r/min离心5 min，去上清（若沉淀不够，可重复1～2次）。

（3）吸取沉淀（少许液体）放入1.5 mL离心管，STE 清洗2次后12 000 r/min 离心7～

8 min。

（4）去上清后加0.5 mL STE，10%SDS 25～30 mL，蛋白酶-K 5 μL（100 μg/mL）37 °C消化过夜，直至沉淀物溶解为止。

（5）等体积饱和酚，倒转摇匀10 min，12 000 r/min离心5 min，吸上层入另一1.5 mL离心管，勿吸入蛋白层。

（6）上清液加等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶10），倒转混匀10 min，以12 000 r/min离心5 min，吸上层入另一1.5 mL离心管。

（7）上清液加等体积氯仿∶异戊醇（24∶1），倒转混匀10 min，以12 000 r/min 离心5 min，取上清入另一EP管。

（8）加1/12体积3 mol/L醋酸钠，混匀后再加3倍体积的4 °C无水乙醇，轻柔振摇。出现白色絮状物（DNA），于-20 °C放置20～30 min，以12 000 r/min于4 °C离心10 min，沉淀DNA，去上清。

（9）加1 mL70%乙醇洗涤，12 000 r/min、4 °C离心10 min，去上清，重复1次。

（10）自然干燥后，用pH 8.0 STE溶解，保存在-20 °C备用。

【注意事项】

（1）提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞），组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解。

（2）含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集。

（3）细胞要适量。细胞过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。

（4）匀浆时应保持低温（冰浴中），匀浆时间应短（30 s/次，2次），针对不同材料，选择适当的裂解预处理。

【讨论与思考】

（1）根据核酸在细胞内的分布、存在方式及其特性，提取过程中采取了什么相应的措施？

（2）为什么从外周血提取DNA尽量用新鲜血？

（3）长期保存DNA样品时其稳定性受哪些因素影响。

（4）简述盐析法提取人外周血DNA的实验原理。