(一)DNA变性
DNA变性是指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂,碱基间的堆积力遭到破坏,不涉及磷酸二酯键的断裂,所以核酸的一级结构保持不变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素,如加热、极端pH、有机试剂如甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等,均可引起核酸分子变性。变性DNA常发生一些理化及生物学性质的改变。
(1)增色效应(hyperchromic effect):是指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。在DNA双螺旋结构中碱基位于内侧,变性时DNA双螺旋解开,于是碱基外露,碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收,故而产生增色效应。
将DNA变性达到50%时,即增色效应达到一半时的温度称为DNA的解链温度Tm,Tm也称熔解温度或DNA的熔点。Tm一方面与DNA的均一性有关,均质DNA的熔解过程发生在一个较小的温度范围内,异质DNA的熔解过程发生在一个较宽的温度范围内;另一方面,Tm与G-C的含量有关,碱基G、C之间有3个氢键,因此G-C含量越高,Tm越高,两者之间呈直线关系,经验公式:(G-C)%=(Tm-69.3)×2.44。
同时,Tm与离子强度有关,离子强度越高,Tm值越大,熔点范围会变窄,因此DNA宜保存在高浓度盐中,一般在1 mol/L NaCl溶液中较稳定。
(2)溶液黏度降低:DNA双螺旋是紧密的刚性结构,变性后被柔软而松散的无规则单股线性结构取代,DNA黏度明显下降。
(3)溶液旋光性改变:变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构型发生改变,因此DNA溶液的旋光性发生变化。(www.daowen.com)
(二)DNA复性
DNA复性是指变性DNA在适当条件下,两条彼此分开的互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象称为复性,它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,故此过程称之为退火(Annealing)。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成。DNA复性后,系列物理化学性质将得到恢复。DNA复性不仅受温度影响,还受到DNA自身特性等其他因素的影响。
(1)温度和时间:一般认为比Tm低25 °C左右的温度是复性的最佳条件,越远离此温度,复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程,降温时间太短以及温差大均不利于复性。
(2)DNA浓度:溶液中DNA分子越多,相互碰撞结合的机会越大,越有利于复性。
(3)DNA一级结构:简单顺序的DNA分子,如多聚(A)和多聚(U)这二种单链序列复性时,互补碱基的配对较易实现。顺序越复杂,则复性越困难。
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