一、蛋白质的两性反应和等电点的简易测定

【实验目的】

（1）掌握蛋白质两性反应和等电点测定的基本原理。

（2）熟悉蛋白质等电点测定的具体操作方法（沉淀法）。

（3）了解其他蛋白质等电点测定方法。

蛋白质的等电点测定与沉淀反应

【实验原理】

蛋白质由许多氨基酸组成，虽然绝大多数的氨基与羧基成肽键结合，但仍有一定数量自由的氨基与羧基，以及酚基、巯基、胍基、咪唑基等酸碱基团，因此蛋白质是两性电解质。调节溶液的酸碱度使之达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动也不向阳极移动，这时溶液的pH称为该蛋白质的等电点（pI）。当溶液的pH低于蛋白质等电点时，即在H+较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳离子；当溶液的pH大于蛋白质等电点时，即在OH-较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成为阴离子。

大多数蛋白质的等电点多接近pH 7.0，略偏酸性等电点的也很多，如酪蛋白等电点为pH 4.55～4.7，卵蛋白的等电点为pH 4.0，血红蛋白的等电点为pH 6.79～6.83；也有偏碱性的，如鱼精蛋白的等电点为pH 12.0～12.4。在等电点时，蛋白质溶解度最小，易沉淀析出。

本实验以酪蛋白为例，观察蛋白质的两性反应和等电点的测定。

【实验试剂与器材】

1. 试 剂

（1）酪蛋白-0.1 mol/L醋酸钠溶液：称取纯酪蛋白0.25 g，置于50 mL容量瓶内，加蒸馏水20 mL及1.0 mol/L NaOH液5 mL（必须准确），摇荡使酪蛋白溶解，然后加1.0 mol/L醋酸钠5 mL（必须准确），最后稀释到刻度，混匀之。

（2）1.0 mol/L醋酸溶液：取冰醋酸5.72 mL，加蒸馏水至100 mL。用标准NaOH液标定之。

（3）0.10 mol/L醋酸溶液。

（4）0.01 mol/L醋酸溶液。

【实验步骤】

酪蛋白等电点的简易测定：

取5支粗细相近的干燥试管，编号后按表7-7的顺序准确地加入各种试剂，加入每种试剂后应混合均匀。静置约20 min，观察每支试管内溶液的混浊度和沉淀，以0、+、++、+++符号表示之。根据观察结果，指出哪一个pH是酪蛋白的等电点。

表7-7　酪蛋白等电点的简易测定

注：各管缓冲液的pH按亨德森-哈塞尔巴赫（Henderson-Hassclbach）方程式计算。

pH=pK+log[盐]/[酸]。例如，在第2管内，醋酸钠液与醋酸液的浓度之比是1∶8。因醋酸的pK 4.7，故此管溶液pH=4.7+log1/8=4.7-0.9=3.8。

【讨论与思考】

（1）什么是蛋白质的等电点？

（2）在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？

二、蛋白质的沉淀反应

【实验目的】

（1）掌握各种蛋白质沉淀反应的基本原理。

（2）熟悉各种蛋白质沉淀反应的具体操作方法。

（3）了解各种蛋白质沉淀反应在科学研究及实际生活中的应用。

【实验原理】

在水溶液中蛋白质分子的表面由于形成水化层和双电层，而成为稳定的胶体颗粒。这种稳定性是有条件的、相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷、脱水，即以固态的形式从溶液中析出，这种作用称为蛋白质的沉淀反应。多种因素可使蛋白质沉淀。

1. 蛋白质的盐析作用

用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程为蛋白质的盐析作用。球状蛋白质是胶体，在高浓度中性盐影响下，蛋白质被盐脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。沉淀出的蛋白质仍保持其天然蛋白质性质，因此，若减低盐的浓度时，还能溶解。

沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度不同，而盐类不同也有差异。所以，在不同条件下，采用不同浓度的盐类可将各种蛋白从混合溶液中分别沉淀析出，该法称为蛋白质的分级盐析。这种方法在蛋白质和酶的分析和制备过程中得到广泛应用。

2. 有机溶剂沉淀蛋白质

如酒精含有亲水基团（—OH基），能夺去蛋白质分子的水化层，在等电点时，加入酒精可使蛋白质沉淀析出。沉淀不同的蛋白质所需酒精的浓度不同。在低温下用酒精短时间作用于蛋白质，可用于蛋白质制备。

3. 重金属离子与生物碱试剂沉淀蛋白质

重金属离子在碱性溶液中（对蛋白质的等电点而言）易与蛋白质形成不溶性的盐类而沉淀。重金属离子沉淀蛋白质的反应通常很完全。因此，生化分析中常用重金属盐除去液体中的蛋白质，临床上则用蛋白质解救重金属盐中毒。

生物碱是植物中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。凡能使生物碱沉淀，或能与生物碱作用成颜色产物的物质，称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。生物碱试剂在酸性溶液中（对蛋白质的等电点而言）易与蛋白质结合形成沉淀析出。

【实验试剂与器材】

1. 实验试剂

（1）1%蛋白溶液：取鸡蛋，分离出蛋黄，将蛋清置于乳钵中研磨后，加蒸馏水约9倍，用棉花过滤，取滤液备用。此滤液中含卵清蛋白。

（2）0.1 mol/L HCl溶液。

（3）0.1 mol/L NaOH溶液。

（4）pH 4.8醋酸缓冲液：取0.2 mol/L醋酸溶液40 mL加0.2 mol/L醋酸钠溶液60 mL，混合后即成。

（5）固体硫酸铵。

（6）95%酒精。

（7）0.5% CuSO4溶液。

（8）饱和苦味酸溶液。(www.daowen.com)

2. 实验器材

试管及试管架、刻度吸管（5 mL）、烧杯（50 mL）、玻璃漏斗、玻璃棒、滤纸、恒温水浴锅等。

【实验步骤】

1. 蛋白质的盐析作用

取1%蛋白溶液5 mL于小烧杯中，加入固体硫酸铵约3.5 g，用玻璃棒搅拌片刻，静置10 min。将上述溶液过滤于试管中。若滤液混浊，在原来滤纸上再过滤一次，直至滤液澄清为止。将滤液置于沸水浴中煮沸，观察有无变化。将滤纸上的沉淀物移于另一试管，加蒸馏水5 mL，看能否溶解，然后加热煮沸，观察有无变化。

2. 乙醇沉淀蛋白质

（1）取试管2支，编号，加入1%蛋白溶液10滴。

（2）于甲号管加pH 4.8缓冲液10滴，再加95%酒精3 mL，观察有无沉淀发生，并解释原因。

（3）于乙号管加0.1 mol/L的NaOH液10滴，再加95%酒精3 mL，观察有无沉淀发生，并解释原因。

（4）然后于乙号管再加0.1 mol/L HCl液10滴，观察有无沉淀发生，并解释原因。

3. 重金属离子与生物碱试剂沉淀蛋白质

（1）取试管2支，各加1%蛋白溶液10滴，然后按如下操作：

甲管：加入0.1 mol/L NaOH溶液4滴，再加0.5% CuSO4溶液4滴。

乙管：加入0.1 mol/L HCl溶液4滴，再加0.5% CuSO4溶液4滴。

记录现象并解释之。

注：在碱性条件下，Cu2+虽可生成Cu(OH)2蓝色絮状沉淀，但因Cu2+含量低，并不干扰本实验中对重金属沉淀蛋白质的现象观察。

（2）取试管2支，各加1%蛋白溶液10滴，然后按如下操作：

甲管：加入0.1 mol/L HCl溶液4滴，再加饱和苦味酸溶液4滴。

乙管：加入0.1 mol/L NaOH溶液10滴，再加饱和苦味酸溶液4滴。

记录现象并解释之。

【讨论与思考】

（1）什么是蛋白质的沉淀反应？哪些因素可以导致蛋白质沉淀？

（2）蛋白质可逆沉淀和不可逆沉淀有什么区别。

（3）盐析法沉淀蛋白质的原理和优缺点分别是什么？

三、蛋白质的热变性

【实验目的】

（1）掌握蛋白质变性的基本原理。

（2）熟悉蛋白质热变性的具体操作方法。

（3）了解蛋白质变性在科学研究及实际生活中的应用。

【实验原理】

蛋白质分子在受到一定物理因素，如热、紫外线、超声波、高压、表面张力、剧烈的震荡、搅拌、研磨等；或化学因素，如酸、碱、有机溶剂、重金属盐类、脲、胍、表面活性剂（如十二烷基硫酸钠等）作用时，导致失活。这一类失活还伴随着其他现象的出现，如蛋白质溶解度降低、一些物化常数的变化等，这些变化都不导致一级结构的破坏，这种现象称为蛋白质的变性。因此，变性作用就是蛋白质在一定的条件处理时，肽键未断裂，特定构象改变，失去生物活力的过程。

蛋白质在50～60 °C以上的溶液中，经过一定时间，往往发生变性。由于加热而产生的蛋白质变性，叫热变性。热变性有可逆与不可逆之分，但是，多数是不可逆的。热变性是由于热的作用，多肽链的运动加强，导致次级键的破坏，蛋白质分子由紧密有序的构象，变成了松散无规律的构象。此时蛋白质分子中某些疏水基团（如烃基）趋向表面，失去水化层，蛋白质的溶解度降低。若在等电点情况下，则蛋白质从溶液中成凝块析出，称为凝固作用。若变性作用在非等电点情况下进行，其性质虽发生改变，但由于带有同种电荷（正电荷或负电荷）故不至于沉淀析出，若此时调节溶液pH到蛋白质等电点，可成絮状沉淀，絮状沉淀在溶液的pH调离等电点时又可消失，絮状沉淀经加热可成凝块析出。

【实验试剂与器材】

1. 试 剂

（1）1%蛋白溶液。

（2）pH 4.8缓冲液。

（3）0.1 mol/L HCl溶液。

（4）0.1 mol/L NaOH溶液。

2. 器 材

试管及试管架。

【实验步骤】

（1）取试管3支，编号，分别加入下列试剂：

① 加入1%蛋白液10滴，再加pH 4.8缓冲液10滴。

② 加入1%蛋白液10滴，加蒸馏水6滴，再加0.1 mol/L HCl液4滴。

③ 加入1%蛋白液10滴，加蒸馏水6滴，再加0.1 mol/L NaOH液4滴。

（2）将以上3管放于沸水浴2 min，观察各管有何现象发生，并解释其原因。

（3）取出上述3管，冷却后，向①管加入0.1 mol/L HCl液（或0.1 mol/L NaOH液）4滴，观察有何现象发生，并说明原因。

（4）向②管逐滴加入0.1 mol/L NaOH液（约4滴），向③管逐滴加入0.1 mol/L HCL液（约4滴），观察沉淀的生成。

【讨论与思考】

（1）什么是蛋白质的变性？哪些因素可以导致蛋白质变性？

（2）蛋白质变性和蛋白质沉淀有什么区别？