【实验目的】

（1）掌握各种蛋白质含量测定方法的基本原理。

（2）熟悉各种蛋白质含量测定方法的具体操作。

（3）了解蛋白质含量测定方法在科学研究中的作用。

本节实验主要为五种蛋白质含量测定方法的验证性实验，要求学生掌握五种经典的蛋白质含量测定方法的基本原理和实验操作技术，熟悉优缺点和影响测定的干扰物质。通过实验的理论和实践学习，对这五种蛋白质含量测定方法有深入的认识，能够在综合性实验中，对于不同来源蛋白质样品选择合适的含量测定方法进行准确的测定。蛋白质含量测定方法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一，是生物大分子研究技术的基础。目前有五种常用的经典方法，即凯氏定氮法，双缩脲法（Biuret法）、Folin-酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法和考马斯亮蓝法（Bradford法），见表7-1。

表7-1　五种蛋白质含量测定方法

凯氏定氮法操作比较复杂，但其测定标准采用的是高纯度无机盐，结果较准确，因此常以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。Biuret法灵敏度差，但有着较快速且干扰物质较少的优点，常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。紫外吸收法虽然准确度较低，但是有着快速和不损耗样品的优点，常用于蛋白质分离纯化等快速测定。Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上，是目前研究中最常用的蛋白质测定方法。值得注意的是，除凯氏定氮法外，其余四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：① 实验对测定所要求的灵敏度和精确度；② 蛋白质的性质；③ 溶液中存在的干扰物质；④ 测定所要花费的时间。

一、凯氏定氮法

凯氏定氮法

【实验原理】

蛋白质是含一定量氮的有机化合物，各种蛋白质含氮量很接近，平均含氮量为16%。蛋白质样品经浓H2SO4消化后，化合物中碳被氧化成CO2逸出，有机氮则全部与H2SO4作用，生成(NH4)2SO4，加纳氏试剂后，产生黄色化合物，可做定量测定。

由胎盘球蛋白的总氮含量与非蛋白氮（non-protein nitrogen，NPN）含量的差，可算得蛋白质含氮量，通过蛋白质含氮量，可换算出蛋白质含量。反应式如下：

【实验试剂与器材】

1. 实验材料

胎盘球蛋白稀释液：1 mL胎盘球蛋白注射液用生理盐水稀释至200 mL。

2. 实验试剂

（1）2/3 mol/L H2SO4。

（2）10%钨酸钠。

（3）标准(NH4)2SO4：取纯(NH4)2SO4（AR）置于110 °C烤箱中30 min，取出后置于干燥箱内冷却，精确称量此干燥的(NH4)2SO4 4.716 g，置于1000 mL容量瓶内，加蒸馏水若干使其溶解，再加入HCl（浓）1 mL（防止生霉），以蒸馏水稀释至刻度，此为储存液，每1 mL含1 mg 氮。取上述标准(NH4)2SO4储存液1 mL，于100 mL容量瓶中，加HCl（浓）0.1 mL以双蒸水稀释至刻度，此为应用液，每1 mL含0.01 mg氮。

（4）10%酒石酸钾钠。

（5）亚硒酸消化液：取亚硒酸0.33 g，溶于300 mL 50% H2SO4中，再加入85% H3PO4 2.5 mL，混匀，储存于密闭玻璃瓶中。

（6）纳氏试剂：称取80 g NaOH，溶于250 mL蒸馏水中，冷却至室温，此为溶液①；称取35 g KI和50 g HgI2，溶解于150 mL蒸馏水中，此为溶液②；将溶液②在搅拌下，缓慢加入到溶液①中，用水稀释定容至500 mL。

3. 实验器材

可见分光光度计、试管、试管夹、酒精灯、旋涡混合器等。

【实验步骤】

（1）NPN滤液制备：取胎盘球蛋白0.1 mL于事先加好的3.5 mL蒸馏水之中，再加入0.2 mL的2/3 mol/L H2SO4，0.2 mL 10%钨酸钠，稍加放置，用干滤纸过滤即得。

（2）氮量测定，见表7-2。

表7-2　氮量测定

续表

各管混匀后，于460 nm处比色。

注：蛋白质含量应不低于5%。

【讨论与思考】

（1）为什么说凯氏定氮法是五种经典蛋白质含量测定方法的基础？

（2）硫酸、钨酸钠、亚硒酸在实验中起什么作用？

（3）酒石酸钾钠的作用是什么？

（4）实验中最后比色时，实验管中可能会出现大量絮状混浊物质，请解释原因，提出快速解决和根本解决的方法。

二、双缩脲法

【实验原理】

双缩脲法

双缩脲（NH3CONHCONH3）是两分子脲经180 °C左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物在540 nm处有最大吸收，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。此法测定范围为1～10 mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生的颜色深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

【实验试剂与器材】

1. 实验试剂

（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（Bovine serum albumin，BSA）或标准酪蛋白，配制成10 mg/mL的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1 mg/mL的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9% NaCl配制，酪蛋白用0.05 mol/L NaOH配制。

（2）双缩脲试剂：称取1.50 g硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0 g酒石酸钾钠，用500 mL蒸馏水溶解，在搅拌下加入300 mL 10% NaOH溶液，用水稀释至1 L，储存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存，若储存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

2. 实验器材

可见分光光度计、试管、旋涡混合器等。

【实验步骤】

（1）标准曲线的测定：取12支试管，1支作空白，1支留作未知样品，其余试管分成两组做标准曲线，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的标准蛋白质溶液，用水补足到1.0 mL，然后加入4.0 mL双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25 °C）下放置30 min，于540 nm处进行比色。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线，见表7-3。

（2）样品的测定：取1.0 mL样品溶液，按上述方法进行操作，取1.0 mL蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加1支试管，如表7-3中的7号试管。注意样品浓度不要超过10 mg/mL。

表7-3　双缩脲法实验表格

【讨论与思考】

（1）双缩脲法测定蛋白质含量的基本原理是什么？

（2）影响双缩脲法测定的干扰物质有哪些？

（3）双缩脲法的优缺点有哪些？

三、Folin-酚试剂法（Lowry法）

Folin-酚法

【实验原理】

Folin-酚试剂法是目前最灵敏的蛋白质含量测定方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在可订购），近年来逐渐被考马斯亮蓝法所取代。此法的显色原理与双缩脲法相同，只是加入了第二种试剂，即Folin-酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：① 在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜离子结合生成复合物；② Folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）。在一定的条件下，蓝色深浅与蛋白质含量成正比。

Folin-酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤，此后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定方法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏，缺点是费时较长，需要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应，并且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%）、硫酸钠（1%）、硝酸钠（1%）、三氯乙酸（0.5%）、乙醇（5%）、乙醚（5%）、丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只需加浓碳酸钠-氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠-氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。

进行测定时，加Folin-酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH 10的情况下发生，故当Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。

此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5 μg。通常测定范围是20～250 μg。

【实验试剂与器材】

1. 实验试剂

（1）试剂甲：① 取10 g Na2CO3，2 g NaOH和0.25 g 酒石酸钾钠，溶解于500 mL蒸馏水中；② 取0.5 g硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解于100 mL蒸馏水中。每次使用前，将50份①与1份②混合，即为试剂甲。

（2）试剂乙：在2 L磨口回流瓶中，加入100 g钨酸钠（Na2WO4·2H2O）、25 g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）及700 mL蒸馏水，再加入50 mL 85%磷酸，100 mL浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10 h，回流结束时，加入150 g硫酸锂（Li2SO4），50 mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15 min，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1 L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1 mol/L左右。

（3）标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清清蛋白或γ-球蛋白，溶于蒸馏水中，浓度为250 μg/mL左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。

2. 实验器材(www.daowen.com)

可见分光光度计、试管、旋涡混合器等。

【实验步骤】

（1）标准曲线的测定：取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组做标准曲线，分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL标准蛋白质溶液（浓度为250 μg/mL），用水补足到1.0 mL，然后每支试管加入5.0 mL试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25 °C）放置10 min。再逐管加入0.5 mL试剂乙（Folin-酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30 min，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650 nm处测定各管溶液的吸光度值。取两组测定的平均值，以标准蛋白质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线。

注：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5.0 mL试剂甲后，开始计时，1 min后，第2支试管加入5.0 mL试剂甲，2 min后加第3支试管，以此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10 min，则第1支试管可立即加入0.5 mL试剂乙，1 min后第2支试管加入0.5 mL试剂乙，2 min后加第3支试管，以此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30 min，然后开始测定吸光度。每分钟测一个样品。

进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格（见表7-4）。表中是每个试管要加入的量（mL），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（μg）和测得的吸光度值。

（2）样品的测定：取0.2、0.4、0.6 mL的样品溶液，按上述方法进行操作，取1 mL蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3支试管，如表7-4中的8、9、10试管。

根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。

注：由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。

表7-4　Folin-酚试剂法实验表格

【讨论与思考】

（1）Folin-酚法测定蛋白质含量的基本原理是什么？

（2）影响Folin-酚法测定的干扰物质有哪些？

（3）Folin-酚法较双缩脲法的优势是什么？

四、考马斯亮蓝法（Bradford法）

【实验原理】

考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝法又称Bradford法，是Bradford于1976年建立起来的一种蛋白质含量测定方法。这种方法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法。

考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰位置（λmax）,由465 nm变为595 nm，溶液的颜色由棕黑色变为蓝色。染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。蛋白质-染料复合物在595 nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

Bradford法的突出优点是：

（1）灵敏度高：据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1 μg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因此光吸收值随蛋白质浓度变化比Lowry法要大得多。

（2）测定快速、简便：只需要加一种试剂，完成一个样品的测定，且只需要5 min左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2 min即可完成，其颜色可以在1 h内保持稳定，且在5 min至20 min之间的稳定性最好，因此完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少：如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

Bradford法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用γ-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、SDS和0.1 mol/L NaOH（如同0.1 mol/L的酸干扰Lowry法一样）。

（3）标准曲线有轻微的非线性，因此不能用Beer定律进行计算，只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

【实验试剂与器材】

1. 实验试剂

（1）标准蛋白质溶液：精确称取γ-球蛋白或BSA，以蒸馏水配制成 1.0 mg/mL或0.1 mg/mL的标准蛋白质溶液。

（2）考马斯亮蓝G-250：称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL 95%乙醇后，再加入120 mL 85%磷酸，用水稀释至1 L后过滤使用。

2. 实验器材

可见分光光度计、试管、旋涡混合器等。

【实验步骤】

1. 标准方法

（1）标准曲线的测定：取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组做标准曲线，按表7-5分别加入0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL的标准蛋白质溶液（浓度为1.0 mg/mL），用蒸馏水补足到0.10 mL，然后各试管中分别加入5.0 mL考马斯亮蓝G-250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难以消除）。加完试剂2～5 min后，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，测定各管中溶液在595 nm处的光吸收值A595。取两组测定的平均值，以标准蛋白质量（μg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线。

注：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

（2）样品的测定：分别取0.02、0.04、0.06 mL样品溶液（浓度约为1.0 mg/mL），按上述方法进行操作，取0.10 mL蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3支试管，如表7-5中的8、9、10试管。

根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质含量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。

0.5 mg/mL牛血清蛋白溶液的A595约为0.50。

表7-5　考马斯亮蓝法实验表格

2. 微量法

当样品中蛋白质浓度较稀时（10～100 μg/mL），可将取样量（包括补加的水）加大到0.5 mL或1.0 mL，空白对照则分别为0.5 mL或1.0 mL H2O，考马斯亮蓝G-250试剂仍加5.0 mL，同时作相应的标准曲线，测定595 nm的光吸收值。

0.05 mg/mL牛血清蛋白溶液的A595约为0.29。

【讨论与思考】

（1）考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理是什么？

（2）影响考马斯亮蓝法测定的干扰物质有哪些？

（3）为什么加入考马斯亮蓝后混匀时要避免气泡的产生？

五、紫外吸收法

【实验原理】

紫外吸收法视频

蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280 nm处有最大光吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280 nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。此外，蛋白质溶液在238 nm的光吸收值与肽键含量成正比。在一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度盐，例如生化制备中常用(NH4)2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。此法特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。

此法的缺点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。

此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而变化，因此要注意溶液的pH，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。

测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280 nm处的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1～1.0 mg/mL。通常用1 cm光径的标准石英比色皿进行比色，当盛有浓度为1 mg/mL的蛋白质溶液时，A280为1.0左右，由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。

许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1% 1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与A1% 1cm值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1 cm时的光吸收值）的关系。文献值A1% 1cm，通常称为百分吸收系数或比吸收系数。

蛋白质浓度=(A280×10)/ A1% 1cm 280nm（mg/mL）（1%浓度≈10 mg/mL）

例如，牛血清清蛋白：A1% 1cm =6.3（280 nm）

溶菌酶：A1% 1cm =22.8（280 nm）

若查不到待测蛋白质的A1% 1cm值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0 mg/mL。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（BSA）。

【实验试剂与器材】

1. 实验试剂

标准蛋白质溶液：精确称取牛血清清蛋白（BSA），配制成1.0 mg/mL的标准蛋白质溶液。

2. 实验器材

紫外-可见分光光度计、石英比色皿、试管等。

【实验步骤】

标准曲线的测定，见表7-6。

表7-6　紫外法标准曲线的测定

用1号管作为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵坐标，各管的蛋白质浓度（mg/mL）或蛋白质量（mg）为横坐标作图，标准曲线应为直线。利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量，也可以用2～6号管A280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的A1% 1cm，280 nm。

【讨论与思考】

（1）紫外法测定蛋白质含量的基本原理是什么？

（2）影响紫外法测定的干扰物质有哪些？