（一）透析与超滤

透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开，如图7-4所示。透析在纯化中极为常用，可除去盐类（脱盐及置换缓冲液）、有机溶剂、低分子量的抑制剂等，透析膜的截留分子量通常为5 kD左右。

超滤法是利用高压力或离心力，使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的滤膜截留不同分子量的蛋白质，如图7-4（b）所示。

图7-4　透析与超滤

（二）密度梯度离心

密度梯度离心亦称平衡密度梯度离心法，如图7-5所示。用超速离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。

多数蛋白质的密度在1.3～1.4 g/cm3，分级分离蛋白质时一般不常用此性质，不过含有大量磷酸盐或脂质的蛋白质与一般蛋白质在密度上明显不同，可用密度梯度法离心与大部分蛋白质分离。密度梯度离心常用的介质有蔗糖、聚蔗糖、氯化铯、溴化钾、碘化钠等。(www.daowen.com)

（三）凝胶过滤

凝胶过滤亦称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex gel）和琼脂糖凝胶（Agarose gel）。分子筛是具有三维空间网状结构的物质，根据网孔不同可制成不同规格。当带有多种蛋白质成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，在凝胶间几乎是垂直的向下运动而径直流出；而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，滞留时间长，这样就可以按分子量的大小先后流出凝胶柱，达到分离的目的，如图7-6所示。

图7-5　密度梯度离心

图7-6　凝胶过滤原理