【实验目的】

（1）掌握纸层析法分离鉴定氨基酸的原理和实验结果分析。

（2）熟悉纸层析法的实验步骤及试剂主要作用。

（3）了解Rf值的定义及该方法的优缺点。

纸层析法分离氨基酸

【实验原理】

用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法。纸层析所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成。滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。溶剂由下向上移动的，称为上行法；由上向下移动的，称下行法。

将样品点在滤纸上（此点称为原点），进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点不等的层析点。溶质在滤纸上的移动速率用Rf值来表示：

只要条件（如温度、展层溶剂的组成）不变，Rf值是常数，故可根据Rf值作定性依据。

样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的Rf值相同或相近，如只用一种溶剂展层不能将它们分开。为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动90°，再用另一溶剂展层，从而达到分离的目的，这种方法称为双向层析法。氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量分析。

【实验试剂与器材】

1. 实验试剂

（1）氨基酸溶液。

甘氨酸溶液：50 mg甘氨酸溶于5 mL水中；丙氨酸溶液：50 mg丙氨酸溶于5 mL水中；亮氨酸溶液：50 mg亮氨酸溶于5 mL水中；组氨酸溶液：50 mg组氨酸溶于5 mL水中。

（2）氨基酸混合液。

甘氨酸50 mg、亮氨酸25 mg、蛋氨酸25 mg共溶于5 mL水中。

（3）展层溶剂。

正丁醇∶80%甲酸∶水=15∶3∶2。

（4）显色液。

在100 mL展层液中加入0.4 g茚三酮即可。

2. 实验器材

层析缸、毛细管、培养皿、层析滤纸、电吹风、针、线、尺、铅笔等。

【实验步骤】(www.daowen.com)

1. 画原点

戴上手套，选用新华1号滤纸，裁成18 cm×15 cm长方形，在距纸一端2 cm处划一基线，在线上每隔2 cm，画一小点作点样的原点，如图6-3所示。

图6-3　氨基酸的单向上行层析

2. 点 样

氨基酸点样用微量注射器或微量吸管，吸取氨基酸样品点于原点（分批点完），点样直径不能超过0.5 cm，边点边用电吹风吹干。

3. 展层和显色

将点好样的滤纸两边缘对齐，用白线缝好，制成圆筒，注意缝线处的滤纸两边不能接触，以免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动太快而造成溶剂前沿不齐。将圆筒状滤纸放入平皿中，注意滤纸勿与皿壁接触。把展层剂倒入平皿内，同时加入显色储备液（每10 mL展层剂加0.1～0.5 mL的显色储备液）进行展层，当溶剂展层至距滤纸上沿1～2 cm时，取出滤纸，做好前沿位置标记后吹干，层析斑点即显蓝紫色。用铅笔轻轻描出各显色斑点的形状，用直尺量出各斑点中心与原点的距离以及溶剂前沿与原点的距离，求出各氨基酸的Rf值，将各显色斑点的Rf值与标准氨基酸的Rf值比较，可得知该斑点的准确成分。

【注意事项】

（1）为防止滤纸被手上的汗液污染，应尽量在操作时戴手套。

（2）复点样时可用吹风机的冷风吹干样品，喷了茚三酮后的显色则要用热风吹干滤纸。

【讨论与思考】

（1）Rf怎么计算？

（2）结果中不同条带分别对应代表哪几个氨基酸？

【小结】

通过本章的学习，我们了解了蛋白质的基本组成单位：氨基酸。本章重点内容包括氨基酸分子的结构和理化性质，以及氨基酸纸层析法分离的实验方法和实验步骤。

【巩固练习】

（1）请写出8种人体必需氨基酸的名称。

（2）对于中性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸，如何计算其等电点？

（3）试总结可定性鉴别氨基酸的反应。

（4）试总结由氨基酸的α-氨基参与的反应。

（5）试总结纸层析法分离氨基酸的原理和结果分析。

【实验小故事】

尽管科学家们已经理清了氨基酸、多肽以及蛋白质之间的关系，但一个关于生命起源的关键问题却始终没有得到解决：用氨基酸合成多肽，需要酶的参与，而主导这一步骤的酶是种蛋白质，但要合成这种蛋白质，我们又需要氨基酸先合成多肽……这是一个经典的“先有鸡，还是先有蛋”的问题。2019年，Matthew Powner教授及其团队在顶尖学术期刊《自然》在线发表了一项有意思的研究：他们发现多肽的合成竟然可以不需要氨基酸的参与！在这项研究中，这支团队将注意力放在了氨基酸的前体分子—— 氨基腈（Aminonitriles）上。他们发现，这类分子天生就具有反应活性，无需先转变为氨基酸，就可以直接形成多肽。这是人类首次有说服力地发现能够在不使用氨基酸的条件下，在水里合成多肽。反应需要的条件并不严酷，可能在早期的地球上寻找到。这项研究具有重大的意义，它除了给生命起源提供线索，还具有当代的实际应用价值。研究人员指出，许多具有生物活性的分子，或是合成材料，都需要进行类似的化学反应。在通常的合成条件下，我们需要事先准备许多昂贵的材料，造成浪费。而这类全新的反应有望更好地为合成生物学服务，带来实际的应用价值。未来，科学家们计划进一步探索更多类似的反应，试图还原出能够天然合成的多肽链，并阐明它们的功能。或许，40亿年前生命起源的奥秘，已经存在于他们的实验室中了。