【实验目的】

（1）掌握全血胆碱酯酶活力测定的实验原理。

（2）熟悉胆碱酯酶活力测定的操作方法。

（3）了解胆碱酯酶活力测定的临床意义。

【实验原理】

血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱与碱性羟胺反应，生成乙酰羟胺，再与三氯化铁在酸性溶液中反应，形成红色羟肟酸铁络合物，其颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。在波长520 nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。

【实验试剂与器材】

1. 实验材料

耳垂血、静脉血：用血色素吸管，取耳垂血20 μL，注入比色管中（事先加入0.98 mL磷酸盐缓冲液），立即进行测定。如不能立即测定，可静脉取血0.5 mL，注入玻璃管中（含肝素或草酸钾抗凝剂），混匀。于保温瓶中加冰运送，置于4 °C冰箱中可保存一周。

2. 实验试剂

（1）碱性羟胺溶液：临用前将139 g/L盐酸羟胺溶液和140 g/L氢氧化钠溶液等体积混合。

（2）磷酸盐缓冲液（pH 7.2）：准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）8.36 g和磷酸二氢钾（KH2PO4）1.36 g，用水溶解并稀释到500 mL，保存在冰箱内。

（3）三氯化铁溶液：称取10 g三氯化铁（FeCl3·6H2O），加0.84 mL盐酸，然后加水100 mL，储存于棕色瓶中。

（4）氯化乙酰胆碱标准液：储备液为70 μmol/mL乙酰胆碱；临用前，取此溶液用磷酸盐缓冲液稀释10倍为应用液，即7 μmol/mL乙酰胆碱。

3. 实验器材

分光光度计、10 mL比色管、漏斗、恒温水浴箱、采血针头、血色素吸管。

【实验步骤】

按表5-8所示加入试剂进行相应操作。

表5-8　胆碱酯酶活力测定

【结果计算】

（1）计算酶活性的绝对值。

式中：Xs—— 水解乙酰胆碱的浓度，μmol（0.02 mL·37°C·30min）。

（2）计算酶活性的相对值。

式中：Y—— 酶活性的相对值，%；

Xs—— 被测血样中酶活性的绝对值，μmol（0.02 mL·37 °C·30 min）；(www.daowen.com)

Xc—— 正常人血中酶活性绝对值，μmol（0.02 mL·37 °C·30 min）；Xc=1.60 μmol。

【临床意义】

正常健康人全血胆碱酯酶活性可低至正常的80%；轻度有机磷农药中毒全血胆碱酯酶活性为正常的50%～70%，中度中毒为30%～50%，重度中毒多在30%以下；慢性有机磷农药中毒全血胆碱酯酶活性在50%以下。酶活性下降与症状轻重并不一致，有时酶活性严重抑制但症状却很轻微。

【注意事项】

（1）本法检测限为2.4 μmol/L，线性范围为2.4～1 000.0 μmol/L。

（2）使用的玻璃器皿洗净后，在1∶3硝酸中浸泡24 h，用水冲洗干净后，再用蒸馏水洗3次，干燥后备用。

（3）取血时不应过度挤压耳垂，如果采血时过度挤压耳垂，采得的血液中血清和组织液所占比例过多，会使结果偏低。

（4）加碱性羟胺和盐酸（1∶2）时，必须严格掌握振摇时间，使其充分反应，否则会影响结果。

（5）加三氯化铁显色后，棕红色铁络合物易褪色，必须控制在20 min内比色完毕。若大批样品分析时，可分批加入三氯化铁溶液，否则会有较大误差。

（6）滤液一定要澄清，如果出现混浊，会使吸光度升高，而胆碱酯酶活性偏低。

（7）氯化乙酰胆碱基质不太稳定，每次测定需做标准管。标准管读数在同一比色计上应保持恒定或仅有较小的变动。

（8）计算胆碱酯酶活性百分数时，应以本地区正常人全血胆碱酯酶活性为基准。

【讨论与思考】

（1）胆碱酯酶活力测定的实验原理是什么？

（2）测定胆碱酯酶活力有什么临床意义？

（3）胆碱酯酶活力测定过程中有哪些注意事项？

【小结】

大多数酶是在生物细胞产生的，以蛋白质为主要成分的生物催化剂。但是近10年来研究表明RNA也是一种真正的生物催化剂。因此酶（Enzyme）是生物体内一类具有催化活性和特定空间构象的生物大分子，包括蛋白质和核酸等。酶量与酶活性的改变都会引起代谢的异常乃至生命活动的停止。本章我们主要介绍了酶的基本概念、分子组成、作用特点、分类命名及影响酶作用的主要因素等。

【巩固练习】

（1）酶的作用有何特点？

（2）影响酶促反应的因素有哪些？

（3）测定Km值有何意义？如何测Km和V？

（4）酶专一性有几种类型？举例说明。

（5）测定人体内某些酶的活性时，反应体系中温度和pH应如何设定？为什么？

【实验小故事】

酶的本质发现过程

在阐明酶的化学本质过程中，科学家James Batcheller Sumner功不可没。Summer于1887年生于美国的马萨诸塞州。在学校里，他爱好物理和化学，也爱好打猎。17岁外出打猎时，被同伴误伤左臂，不得不截去左前臂。为了增强体质，他并没有放弃体育活动，照样打网球、滑雪、玩弹子球和溜冰等。1906年，Sumner进哈佛医学院专攻化学，1910年毕业。1912年，到哈佛医学院随Otto Folin教授学习化学，Folin认为独臂人很难在化学方面获得成功，劝Sumner改学法律。Sumner仍坚持己见，并在1913年获得硕士学位，1914年获博士学位。1917年他决定分离酶，并选择脲酶（Urease）作为分离对象，起初并不成功。但1922年的一天，他改变以往用水、甘油和乙醇提取脲酶的方法，而改用30%的丙酮。当他取出一滴丙酮抽提液放在显微镜下观察时，发现液体中长出许多小晶体。离心收集这些晶体后，发现它有很高的脲酶活性，分离后的脲酶纯度一下子增加了700～1 400倍，这是其他纯化方法难以比拟的。他首先把好消息通过电话告诉了妻子，后来他又做了一系列令人信服的实验，证明脲酶是蛋白质。Summer成功地分离和结晶出脲酶。起初遭到很多生化学家的忽略和怀疑。1930年，John Howard Northrop从胃蛋白酶商品制剂中分离到了结晶的胃蛋白酶，以后他又结晶了一系列其他的酶，并用更严密的方法证明酶是蛋白质。酶本质的揭示为现代酶学的发展奠定了基础。1946年，Sumner和Northrop一起荣获诺贝尔奖。