【实验目的】

（1）掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的实验原理。

（2）熟悉SOD活力测定方法和基本操作。

（3）了解SOD的作用特性。

【实验原理】

超氧自由基是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2-），生成H2O2和O2。H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。

SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn-SOD和Cu·Zn-SOD。由于超氧自由基为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法，并利用各种呈色反应来测定。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成黄色化合物，继而还原成一种蓝色物质，在560 nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色物质生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD溶液，光照一定时间后测定560 nm波长下各溶液吸光度，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。以SOD溶液量（mL）为横坐标，抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，绘制出二者相关曲线，根据SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50%时的酶量作为一个酶活力单位（U）。

【实验试剂与器材】

1. 实验材料

小麦、玉米、水稻、棉花等新鲜叶片。

2. 实验试剂

（1）0.1 mol/L pH 7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液。

A液（0.1 mol/L Na2HPO4溶液）：准确称取3.5814 g Na2HPO4·12H2O于100 mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4 °C冰箱中保存备用。

B液（0.1 mol/L NaH2PO4溶液）：准确称取0.780 g NaH2PO4·2H2O于50 mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4 °C冰箱中保存备用。

取上述A液183 mL与B液17 mL充分混匀后即为0.1 mol/L pH 7.8的磷酸钠缓冲液。4 °C冰箱中保存备用。

（2）0.026 mol/L 甲硫氨酸（Met）磷酸钠缓冲液：准确称取L-甲硫氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879 g于100 mL小烧杯中，用少量0.1 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.8）溶解后，移入100 mL容量瓶中并用0.1 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.8）定容至刻度，充分混匀（现用现配）。4 °C冰箱中保存可用1～2 d。

（3）7.5×10-4 mol/L NBT溶液：准确称取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533 g于100 mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。4 °C冰箱中保存可用2～3 d。

（4）含1.0 μmol/L EDTA的2 × 10-5 mol/L核黄素溶液。

A液：准确称取EDTA（MW=292）0.00292 g于50 mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。

B液：准确称取核黄素（MW=376.36）0.0753 g于50 mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。

C液：合并A液和B液，移入100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液为含0.1 mmol/L EDTA的2 mmol/L 核黄素溶液。4 °C冰箱中保存可用8～10 d。该溶液应避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，置于4 °C冰箱中保存。

当测定SOD活性时，将C液稀释100倍，即为含1.0 μmol/L EDTA的2×10-5 mol/L核黄素溶液。

（5）0.05 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.8）：取0.1 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.8）50 mL，移入100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4 °C冰箱中保存备用。

（6）石英砂。

3. 仪 器

分光光度计、万分之一分析天平、高速冷冻离心机、冰箱、光照箱（4 500 Lux）、带盖瓷盘、研钵、离心管、烧杯、移液管、微量移液器、量筒、容量瓶等。

【实验步骤】

1. 酶液的制备

按每克鲜叶加入3 mL 0.05 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.8）及少量石英砂，于冰浴中的研钵内研磨成匀浆，定容到5 mL刻度离心管中，以8 500 r/min（10 000×g）离心30 min（4 °C），上清液即为SOD粗酶液。

2. 酶活力的测定

取8个洗净干燥好的小烧杯编号，按表5-6加入各试剂及酶液，反应系统总体积为3 mL。其中4～8号杯中磷酸钠缓冲液和酶液可根据实验材料中酶液浓度及酶活力进行调整（如酶浓度大、活性强时，酶用量适当减少）。

表5-6　反应系统中各试剂及酶液的加入量　　　　　　　（单位：mL）

(www.daowen.com)

各试剂全部加入后，充分混匀，取1号小烧杯置于暗处，作为空白对照，比色时调零。其余7个小烧杯均放在温度为25 °C，光强为4500 Lux的光照箱内（安装有3根20 W的日光灯管）照光15 min，然后立即遮光终止反应。在560 nm波长下以1号杯溶液调零，测定各杯溶液吸光度并记录结果。以2、3号杯溶液吸光度的平均值作为NBT光还原率100%，根据其他各杯溶液的吸光度分别计算出不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标，抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，作出二者相关曲线。

【结果计算】

（1）将560 nm波长下待测管液的吸光度填入表5-7。

表5-7　测定数据

以酶液量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，绘制出二者相关曲线。以60 min、SOD抑制NBT光还原相对百分率为50%时所需的酶量（μL）作为一个酶活力单位（U）。

（2）SOD总活力计算。

式中：A—— 酶活力，U/g（FW）·h；

V—— 酶提取液总体积，mL；

B—— 一个酶活力单位的酶液量，μL；

W—— 样品鲜重，g；

T—— 反应时间，min；

1 000—— 1mL = 1 000 μL；

60—— 1h = 60 min。

（3）抑制NBT光还原率计算。

式中：D1—— 2、3号杯液的吸光度平均值；

D2—— 加入不同酶液量的各杯液的吸光度值。

注：有时因测定样品的数量多，每个样品均按此法测定酶活力工作量将会很大，也可每个样品只测定1个或2个酶液用量的吸光度值，按下式计算酶活力：

式中：D1—— 2、3号杯液的吸光度平均值；

D2—— 测定样品酶液的吸光度；

50%—— 抑制率50%。

其他各因子代表的内容与上述SOD酶活力计算公式的各因子代表的内容相同。

【注意事项】

（1）富含酚类物质的植物（如茶叶）在匀浆时产生大量的多酚类物质，会引起酶蛋白不可逆沉淀，使酶失去活性，因此在提取此类植物SOD时，必须添加多酚类物质的吸附剂，将多酚类物质除去，避免酶蛋白变性失活。一般在提取液中加1%～4%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。

（2）测定时的温度和光化反应时间必须严格控制一致。为保证各微烧杯所受光强一致，所有微烧杯应排列在与日光灯管平行的直线上。

【讨论与思考】

（1）简述NBT光化还原法测定SOD活力的实验原理。

（2）为什么SOD活力不能直接测得？

（3）超氧自由基为什么能对机体活细胞产生危害，SOD如何减少超氧自由基的毒害？