【实验目的】

（1）掌握测定淀粉酶活力的实验原理。

（2）熟悉淀粉酶活力测定的方法和基本操作。

（3）了解淀粉酶活力测定的意义。

【实验原理】

淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。植物中最重要的淀粉酶是α-淀粉酶β-淀粉酶。

α-淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α-1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α-极限糊精和少量葡萄糖。Ca2+能使α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH 3.6以下可使其钝化。β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α-1,6键时停止。单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要Ca2+及Cl-等辅助因子，最适pH偏酸，与α-淀粉酶相反，它不耐热但耐酸，70 °C保温15 min可使其钝化。通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。可以先测定（α+β）淀粉酶总活力，然后在70 °C加热15 min，钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶活力，用总活力减去α-淀粉酶活力，就可求出β-淀粉酶活力。

淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。

【实验试剂与器材】

1. 实验材料

萌发3天的小麦芽。

2. 实验试剂

（1）1 %淀粉溶液。

（2）0.4 mol/L氢氧化钠。

（3）pH 5.6柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸20.01 g，溶解后定容至 1 000 mL，为A液。称取柠檬酸钠29.41 g，溶解后定容至1 000 mL，为B液。取A液13.7 mL与B液26.3 mL混匀，即为pH 5.6之缓冲液。

（4）3,5-二硝基水杨酸：精确称取1 g 3,5-二硝基水杨酸溶于20 mL 1 mol/L 氢氧化钠中，加入50 mL蒸馏水，再加入30 g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100 mL，盖紧瓶塞，防止CO2进入。

（5）麦芽糖标准液（1 mg/mL）：称取0.100 g麦芽糖，溶于少量蒸馏水，定容至100 mL。

3. 实验仪器

电子天平、离心机、恒温水浴锅、分光光度计、研钵、离心管、试管等。

【实验步骤】

1. 酶液提取

称取2 g萌发3天的小麦种子（芽长1 cm左右），置研钵中加少量石英砂和2 mL左右蒸馏水，研成匀浆，无损地转入100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL，每隔数分钟振荡1次，提取20 min。3 000 r/min离心10 min，取上清液备用。

2. α-淀粉酶活力测定

（1）取试管4支，标明2支为对照管，2支为测定管。

（2）于每管中各加酶液l mL，在（70±0.5）°C恒温水浴中准确加热15 min，钝化β-淀粉酶。取出后迅速用流水冷却。(www.daowen.com)

（3）在对照管中加入4 mL 0.4 mol/ L 氢氧化钠。

（4）在4支试管中各加入1 mL pH 5.6的柠檬酸缓冲液。

（5）将4支试管置另一个（40±0.5）°C恒温水浴中保温15 min，再向各管分别加入40 °C下预热的1 %淀粉溶液2 mL，摇匀，立即放入40 °C恒温水浴准确计时保温5 min。取出后向测定管迅速加入4 mL 0.4 mol/L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。

3. 淀粉酶总活力测定

取酶液5 mL，用蒸馏水稀释至100 mL，为稀释酶液。另取4支试管编号，2支为对照，2 支为测定管。然后加入稀释之酶液l mL。在对照管中加入4 mL 0.4 mol/L氢氧化钠。4支试管中各加1 mL pH 5.6柠檬酸缓冲液。以下步骤重复α-淀粉酶测定第（5）步的操作，同样准备测糖。

4. 麦芽糖的测定

（1）标准曲线的制作取25 mL刻度试管7支，编号。分别加入麦芽糖标准液（1 mg/mL）0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0 mL，然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达2.0 mL，再各加3,5-二硝基水杨酸试剂2.0 mL，置沸水浴中加热5 min。取出冷却，用蒸馏水稀释至25 mL。混匀后用分光光度计在520 nm 波长下进行比色，记录吸光度。以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量（mg）为横坐标，绘制标准曲线。

（2）样品的测定：取步骤2、3中酶作用后的各管溶液2 mL，分别放入8支25 mL刻度试管中，再各加入2 mL 3,5-二硝基水杨酸试剂。以下操作同标准曲线制作，根据样品吸光度，从标准曲线查出麦芽糖含量，最后进行结果计算。

【结果处理】

式中：A—— α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量，mg；

A0—— α-淀粉酶的对照管中麦芽糖量，mg；

B——（α+β）淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量，mg；

B0——（α+β）淀粉酶的对照管中麦芽糖量，mg；

VT—— 样品稀释总体积，mL；

VU—— 比色时所用样品液体积，mL；

W—— 样品重，g。

【注意事项】

（1）样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。

（2）为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达5 min时取出试管，立即加入3,5-二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。同时恒温水浴温度变化应不超过±0.5 °C。

（3）如果条件允许，可采用不同材料，例如，萌发1 d、2 d、3 d、4 d的小麦种子，比较测定结果，以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化。

【讨论与思考】

（1）淀粉酶活性测定的原理是什么？

（2）酶反应中为什么要加入pH 5.6柠檬酸缓冲液？为什么在40 °C进行保温？

（3）测定酶活力，应注意什么问题？