【实验目的】

（1）掌握测定蛋白酶活力的原理。

（2）熟悉测定蛋白酶活力的基本操作和酶活力的计算方法。

（3）了解测定酶促反应速度的方法。

【实验原理】

本实验以酪蛋白为底物，枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸，在碱性条件下酪氨酸与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该化合物在680 nm处有最大光吸收。酪氨酸含量与颜色深浅呈正比，因而可测定酪氨酸含量并计算酶活力。

【实验试剂与器材】

1. 实验试剂

（1）酚试剂。

（2）0.2 mol/L盐酸溶液。

（3）0.04 mol/L氢氧化钠溶液。

（4）0.55 mol/L碳酸钠溶液。

（5）10%三氯乙酸溶液。

（6）0.2 mol/L，pH 7.5磷酸缓冲液。临用时稀释10倍即为0.02 mol/L，pH 7.5磷酸缓冲液。

（7）标准酪氨酸溶液（50 μg/mL）：称取12.5 mg已烘干至恒重的酪氨酸，用0.2 mol/L盐酸约30 mL溶解后，用蒸馏水定容至250 mL。

（8）酪蛋白溶液（0.5%）：称取1.25 g酪蛋白，用0.04 mol/L NaOH（约20 mL）溶解，然后用0.02 mol/L，pH 7.5磷酸缓冲液定容到250 mL，该试剂最好用时现配。

（9）枯草某些菌蛋白酶：称取1 g枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.02 mol/L，pH 7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100 mL，振荡15 min，充分溶解，用干纱布过滤，取滤液，放冰箱备用。使用时用缓冲液适当稀释（视酶活力高低而定）。

2. 实验仪器

试管、试管架、移液管、恒温水浴锅、分光光度计。

【实验步骤】

1. 酪氨酸标准曲线制作(www.daowen.com)

取6支试管编号，按顺序分别加入0、0.20、0.40、0.60、0.80和1.00 mL标准酪氨酸溶液，再用水补足到1.00 mL，摇匀后加入0.55 mol/L碳酸钠5.0 mL，摇匀。依次加入Folin-酚试剂1.00 mL，摇匀并计时，于30 °C恒温水浴中保温15 min。然后于680 nm波长处测吸光度（以1号管作对照）。以酪氨酸含量（μg）为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线。

2. 酶活力测定

（1）酶反应过程：在一支试管中，加入2.0 mL 0.5%酪蛋白溶液，于30 °C水浴中预热5 min后，再加入1.0 mL枯草杆菌蛋白酶液（已预热5 min），立即计时，准确保温10 min后，由水浴中取出，并立即加入2.0 mL 10%三氯乙酸溶液，摇匀后静止数分钟，干滤纸过滤，干净试管收集滤液（A液）。

另取一支试管，加入1.0 mL蛋白酶后，再加入2.0 mL 10%三氯乙酸溶液，摇匀，旋转数分钟后再加入2.0 mL 0.5%酪蛋白溶液，然后于30 °C水浴保温10 min，同样过滤收集滤液（B液）。

以上两过程，应各做一次平行实验。

（2）滤液中酪氨酸含量测定：取3支试管，分别加入1.0 mL水、A液、B液，然后各加入5.0 mL 0.55 mol/L碳酸钠溶液和1.0 mL Folin-酚试剂，按标准曲线制作方法保温并测吸光度。查标准曲线，A、B液中酪氨酸含量之差即为酶催化所产生。

【结果计算】

根据定义，本实验测得1 g酶制剂所含酶活力单位数。

式中：K—— 标准曲线上A=1时对应的酪氨酸微克数；

T—— 酶促反应时间（min），本实验T=10；

V—— 酶促反应液体积（mL），本实验V=5；

N—— 酶溶液稀释倍数（指1 g酶溶液并稀释至N mL用于测定）。

【注意事项】

（1）本实验所用的Folin-酚试剂只是测蛋白质含量时的Folin-酚试剂B。

（2）酶反应滤液中因加入三氯乙酸使pH降低，测酪氨酸含量时若显色异常，应检查显色液pH是否大于8。必要时，应适当增加Na2CO3用量。

（3）试液中有其他酚类化合物、柠檬酸或铜离子时对酪氨酸显色有干扰作用。

【讨论与思考】

（1）蛋白酶分为哪几类？

（2）蛋白酶活力测定过程中应注意些什么？

（3）蛋白酶活力测定的原理是什么？