【实验目的】

（1）掌握测定米氏常数Km的原理。

（2）熟悉脲酶Km值的测定方法。

（3）了解测定脲酶Km值的意义。

【实验原理】

脲酶是氮素循环的一种关键性酶，它催化尿素与水作用生成碳酸铵，在促进土壤和植物体内尿素的利用上有重要作用。脲酶早已引起人们的重视，并对其进行了多方面的研究。

在碱性条件下，碳酸铵与奈氏试剂作用产生橙黄色的碘化双汞铵。在一定范围内，呈色深浅与碳酸铵量成正比。故可用比色法测定单位时间内酶促反应所产生的碳酸铵量，从而求得酶促反应速度。

在保持恒定的最适条件下，用相同浓度的脲酶催化不同浓度的脲发生水合反应。在一定限度内，酶促反应速度与脲浓度成正比。用双倒数作图法可求得脲酶的Km值。

【实验试剂与器材】

1. 实验材料

大豆粉。

2. 实验试剂

（1）1/10 mol/L脲：称取尿素15.015 g，水浴后定容至250 mL。

（2）不同浓度脲液：用1/10 mol/L脲稀释成1/20、1/30、1/40、1/50 mol/L的脲液。

（3）1/15 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液：Na2HPO4 5.969 g溶于250 mL蒸馏水中；NaH2PO4 2.268 g溶于250 mL蒸馏水中。取Na2HPO4溶液60 mL，NaH2PO4溶液40 mL混匀，即为1/15 mol/L pH 7.0 磷酸盐缓冲液。

（4）10%硫酸锌：20 g ZnSO4溶于200 mL蒸馏水中。

（5）0.5 mol/L氢氧化钠：5 g NaOH，溶于250 mL蒸馏水中。

（6）10%酒石酸钾钠：称取20 g酒石酸钾钠溶于200 mL蒸馏水中。

（7）0.005 mol/L 硫酸铵标准液：准确称取0.6610 g硫酸铵加入蒸馏水溶解后，定容至1 000 mL。

（8）30%乙醇：60 mL 95%乙醇，加水130 mL，摇匀。

（9）奈氏试剂：① 甲：8.75 g KI溶于50 mL水中。② 乙：8.75 g KI溶于50 mL水中。③ 丙：7.5 g HgCl2溶于150 mL水中。④ 丁：2.5 g HgCl2溶于50 mL水中。⑤ 甲与丙混合，生成朱红色沉淀。用蒸馏水以倾泻法洗沉淀几次，洗好后将乙液倒入，令沉淀溶解。然后将丁液逐滴加入，至红色沉淀出现摇动也不消失为止，定容至250 mL。⑥ 称取 NaOH 52.5 g，溶于200 mL蒸馏水中，冷却。⑦ 混合⑤、⑥，并定容至500 mL。上清液转入棕色瓶中，存暗处备用。

3. 实验器材

试管、吸管、漏斗、分光光度计、电热恒温水浴锅、离心机、康氏振荡机。

【实验步骤】

（1）脲酶提取：称大豆粉1 g，加30%乙醇25 mL，振荡提取l h。4 000 r/min离心10 min，取上清液备用。(www.daowen.com)

（2）取试管5支编号，按表5-3操作。

表5-3　脲酶提取操作方法

在旋涡振荡器上混匀各管，静置5 min后过滤。

（3）另取试管5支编号，与上述各管对应，按表5-4加入试剂（mL）。

表5-4　对照组操作方法

迅速混匀各管，然后在460 nm比色，光径1 cm。

（4）制作标准曲线，按表5-5加入试剂（mL）。

表5-5　标准曲线操作方法

迅速混匀各管，在460 nm比色，绘制标准曲线。

【实验结果】

在标准曲线上查出脲酶作用于不同浓度脲液生成碳酸铵的量，然后取单位时间生成碳酸铵量的倒数即1/V为纵坐标作双倒数图，以对应的脲液浓度的倒数即1/[S]为横坐标作双倒数图，求出Km值。

【注意事项】

（1）准确控制各管酶反应时间，尽量一致。

（2）按表中顺序加入各种试剂。

（3）奈氏试剂腐蚀性强，勿洒在试管架和实验台面上。

【讨论与思考】

（1）本实验的原理是什么？

（2）除了双倒数作图法，还有哪些方法可求得Km值？

（3）要比较准确的测得脲酶的Km值，实验操作应注意哪些关键环节？

（4）测定酶促反应特征常数Km有何意义？

（5）酶促反应有什么特点？