（一）酶活力测定的基本知识

酶活力是通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即测定酶促反应的速率来获得的。一般情况下，产物和底物的改变量是一致的，但测定产物的生成要比测定底物的减少为好，这是由于反应体系中使用的底物往往是过量的，而反应时间通常又很短，尤其是在酶活力很低时，底物减少量仅占加入量的很小比例，因此测定不易准确；反之，产物从无到有（如不纯的酶制剂中内源性产物不计的话），只要测定方法灵敏，准确度可以很高，故酶活力测定绝大多数是采用测定产物生成速率的方法。

测定酶活力时通常都附有适当的对照（Control）以消除非酶促反应所生成的产物，常用的对照有以下几种，可根据具体情况予以选择。

1. 样品对照

若测定酶活力的样品是粗提取液，属于非常不纯的酶制剂，往往含有所欲测定的产物，也可能在保温时由于内源性底物的旁反应产生相同的产物，这些可通过不加底物单加样品的样品对照予以消除。

2. 底物对照

某些酶的底物能自发（非酶促）地分解成所欲测定的产物，可以通过不加样品单加底物的底物对照予以消除。

3. 时间对照

若酶制剂不纯（含有产物）和底物自发分解的情况并存，则必须做一个酶和底物都加入但反应时间为零的对照，即先用蛋白沉淀剂或其他试剂停止反应，再加入底物。

在双底物反应时，对照管可以加入酶制剂和两种底物中的一种，因缺乏另一种底物，不可能生成产物，至于应加入两种底物中的哪一种可以根据预实验决定。

测定管中的产物量必须减去对照管中的产物才是真正由酶促反应所生成的产物量。

（二）酶活力测定的方法

1. 定时法

测定酶反应开始后某一时间内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法称为定时法。因t1和t2是整个反应历程的两个点，故又称两点法，其中t1一般取反应开始的时间，在酶反应进行一定时间（t2）后终止反应，如加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等，然后测定底物或产物的变化。

这种方法的优点是简单，因最后测定产物时酶反应已被终止，故比色池无需保温装置，显色剂的选择也可不考虑对酶活力的影响。缺点是如果不用预实验确定，无法了解酶作用的这段时间内是否都是零级反应，故很难保证测定结果的真实性。

因此，用定时法测定酶活力时，应先做预实验来确定线性时间，并在线性时间内进行测定，否则，不能用[p]除以t来表示每分钟产生的[p]，并用其计算酶活力单位。

2. 连续监测法(www.daowen.com)

连续测定（每15 s～1 min监测一次）酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应初速度的方法称为连续监测法，又称动力学法或速率法。定时法只测定两个时间点，而连续监测法则进行多点连续测定。

这种方法的优点是可将多点的测定结果（[s]或[p]的变化）连接成线，很容易找到成直线的区段，可以观察到是否偏离零级反应，因而可选择线性反应期来计算酶活力，不需要终止反应。此法也可在反应曲线的拐点处求出其切线的斜率，即初速度。连续监测法测定的结果通常较定时法高，也较为准确，因为前者测定时间较短，而在酶反应的初始阶段底物最充裕，而产物的抑制作用、可逆反应、酶的变性作用等均很小。

用连续监测法测定的缺点是因酶和底物边保温边测定的需要，仪器（比色计或分光光度计）必须有保温装置，而且产物（或底物）应是可被直接测定的化合物，且借以测定的特殊性质，必须与底物（或产物）有明显差别，否则，需要加入其他试剂（如显色剂、酶试剂等），将其转变成可测物质，但必须考虑到加入的酶试剂或显色剂对待测酶是否有影响。

3. 平衡法

通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法称为平衡法，或称终点法。因定时法是在酶反应的动态期进行测定，故需终止反应后才能测定，而平衡法则不需要，因在平衡期中任何一点进行测定，底物和产物的量都不再变化。

用平衡法测定时，因产物的增加或底物的减少与反应时间不成线性，故不能把[p]或[s]的总变化量除以t来代表每分钟产物或底物的变化。另外，平衡法也会受到产物抑制、可逆反应等因素的影响，由于反应时间较定时法更长，故这种影响会更大，测定结果也较连续监测法低，不能代表初速度，也不是零级反应的速度。但是与定时法相同，只要待测标本与正常标本在相同条件下反应并测定，亦能以此判断出待测标本酶活力的相对大小。而且，对于有些零级反应期很短的酶促反应，用连续监测法和定时法很难测出其初速度，也只得采用平衡法测定。

（三）酶活力的表示法

酶活力的大小是以酶单位数表示。所谓酶单位是在某一特定条件下，使酶反应达到某一速度所需要的酶量，而速度即指单位时间（秒、分、小时）内反应物的变化量（微克、毫克、微摩尔、摩尔等）。酶单位一般有下列3种表示方法。

1. 惯用单位

20世纪60年代前，各种酶活力的表示法或酶单位的定义没有统一的标准，不同酶、甚至同一种酶不同的测定法可有不同的定义。如谷丙转氨酶的改良穆氏法、金氏法和赖氏法的定义以及磷酸酶的布氏法、金-阿二氏法和皮-劳二氏法的定义均不相同，因此正常范围也相差很大，容易造成混乱，有时甚至直接用测得的物理量，如单位时间的吸光度变化（ΔA/Δt）来表示酶单位。

2. 国际单位

1961年，国际生化学会（IUB）酶学委员会建议使用统一的国际单位（IU），规定一个国际单位（IU）为在实验规定的条件下（如温度为25 °C、最适pH、最适底物浓度时），每分钟催化一个微摩尔底物变化所需要的酶量。酶的浓度可以IU/L或IU/mL来表示。当底物为蛋白质、多糖等含有多个能被酶作用的键或基团时，可用催化一个微摩尔被作用的基团或键的变化来表示酶单位。如采用物理方法测定，应该在物理量与化学量之间建立对应关系进行换算。

国际单位的应用有利于比较同一样品中不同酶的活力，但也有不少缺点，如：① 从惯用单位换算成国际单位比较麻烦；② 某些酶作用于Mr不明的大分子底物（如淀粉酶、胃蛋白酶等），采用底物减少法来定量时，无法计算其底物减少的微摩尔数；③ 同一种酶用不同的方法测定，换算成国际单位时，其结果仍不相同。欧美各国由于地理条件及实验室内温度的不同，常采用不同的测定温度，如25 °C、30 °C、37 °C等，这也导致即使使用国际单位表示酶活力，其正常参考范围也是不同的。

3. katal单位

1972年，酶学委员会又提出一种新的酶单位katal（简称kat），即在确定的最适反应条件下每秒钟催化一摩尔底物变化所需要的酶量为1 kat单位。