【实验目的】

（1）掌握磷硫铁法测定胆固醇的原理及方法。

（2）熟悉提取实验步骤及试剂主要作用。

（3）了解测定血清总胆固醇的临床意义。

【实验原理】

血清中的总胆固醇（Total cholesterol，TC）包括游离胆固醇和胆固醇酯。胆固醇广泛分布于全身各组织，血浆中的胆固醇多为胆固醇酯。胆固醇在体内发挥着重要的生理功能，参与合成胆汁酸、类固醇激素及维生素D3等重要的物质。高胆固醇血症常见于动脉粥样硬化、家族性高胆固醇血症、糖尿病肾病综合征、甲状腺功能减退等。低胆固醇血症见于严重贫血、甲状腺功能亢进、营养不良。

血清经无水乙醇处理，血清中蛋白质被沉淀，胆固醇等则溶于无水乙醇中。在乙醇提取液中加磷硫铁试剂（即浓硫酸和三价铁溶液），胆固醇及其酯与试剂形成比较稳定的紫红色化合物，呈色程度与胆固醇及其酯含量成正比，可用比色法于560 nm波长处定量测定。

【实验试剂与器材】

1. 实验试剂

（1）待测血清样品。

（2）三氯化铁溶液：三氯化铁10 g，溶于磷酸定容至100 mL，4 °C避光保存1年。

（3）磷硫铁试剂：取三氯化铁溶液1.5 mL，浓硫酸稀释至100 mL，避光保存。

（4）胆固醇标准储存液（0.8 mg/mL）：准确称取胆固醇80 mg，溶于无水乙醇后定容至100 mL。

（5）胆固醇标准溶液（0.08 mg/mL）：将储存液用无水乙醇准确稀释10倍即得。

（6）乙醇工作液：使用蒸馏水和无水乙醇配制95%（V/V）的乙醇工作液。

2. 实验器材

721分光光度计、离心机。

【实验步骤】

1. 胆固醇的提取

吸取血清0.1 mL置于洁净干燥离心管内，加入无水乙醇0.4 mL，摇匀后再加入无水乙醇2.0 mL，摇匀后静置10 min，3 000 r/min，离心5 min，取上清液（即胆固醇抽提液）备用。(www.daowen.com)

2. 胆固醇测定

取试管3支，标记后按表4-1所示加样，混匀后室温静置10 min，在560 nm比色，记录吸光度值。

表4-1　胆固醇测定加样程序

3. 计 算

式中：Cs—— 标准液中胆固醇浓度，0.08 mg/mL；

Au—— 样品液的吸光度；

As—— 标准液的吸光度；

0.04—— 100 mL血清胆固醇乙醇提取液相当于0.04 mL血清。

胆固醇参考范围：110～220 mg/mL。

【注意事项】

（1）磷酸、硫酸均具有化学腐蚀性，在配置相关试剂时一定要戴手套和口罩，按规范操作。

（2）在待测血清样品制备方面，最好采用清晨空腹抽取血样（隔夜前忌食高脂）。

（3）胆固醇标准溶液称量一定要准确，否则会对该定量检测实验产生影响。

【讨论与思考】

（1）高胆固醇引起的疾病有哪些？

（2）讨论高胆固醇临床检测的意义，以及日常生活中高胆固醇血症的预防措施。