【实验目的】

（1）掌握吸附层析的原理。

（2）熟悉薄层层析的操作技术：薄板的制备、活化、点样、展层、显色。

（3）了解Rf计算及样品鉴定。

【实验原理】

动物脑组织富含多种脂质，有甘油磷脂、鞘氨醇磷脂、糖脂、胆固醇等。本实验采用Blign和Dyer方法，提取猪脑脂质，快速有效。首先使用一相醇溶液系统（即氯仿-甲醇-水），将各种脂质一并提取出来，提取物再用氯仿和水稀释，以形成二相系统，水溶性杂质易分配进入甲醇-水相，而脂质进入氯仿相，从而实现分离。

薄层层析（Thin-Layer-Chromatography，TLC）是将作为固定相的支持剂涂于支持板上面进行的一种层析技术。此法较相应支持剂材料做成的柱层析、纸层析等有更多的优越性。最突出的特点是操作简便和层析速度快。缺点是对生物大分子分离效果欠佳。近年来，由于薄层板的不断改进，实施薄层层析的操作仪器化，已将一般的薄层层析发展成为高效薄层层析（HPTLC），可在几分钟内将含有多至十余个组分的样品分离开。各种规格的薄层预制板及专门仪器已趋向商品化。

制作薄层层析用的硅胶一般有两类。一类是不加添加剂的称硅胶H；另一类是添加了黏合剂（如石膏）称硅胶G。有的为便于鉴定，还加入了特殊的荧光剂，常以字母F表示。不同类型的硅胶各有不同的用途。本实验是用硅胶H为支持剂，用薄层层析技术分离鉴定脑组织所含的脂质。

【实验试剂与器材】

1. 实验材料

新鲜猪脑。

2. 实验试剂

氯仿、95%乙醇、0.1%碳酸氢钠、甲醇、精制硅胶H。

3. 实验器材

剪刀、研钵、离心机、层析板、干燥器、层析缸。

【实验步骤】

1. 脂质的提取

称取新鲜猪脑1.5 g，用剪刀剪碎，置于研钵内磨成浆后，倒入匀浆管内，冰浴中匀浆2 min。向匀浆内加入7.5 mL抽提液Ⅰ，继续匀浆2 min。然后将匀浆液于2 500 r/min离心10 min。吸取上清液储存于分液漏斗中，沉淀再加入9.5 mL抽提液Ⅱ，搅拌成悬浊液后再匀2 min，随之离心10 min。合并两次上清液，加入氯仿和水各2.5 mL，在分液漏斗内间歇摇振2 min，然后静置30 min左右，提取液逐渐分成两相（注意观察分相过程）。上相为甲醇-水相，下相为含脂质混合物的氯仿相，从漏斗分流出氯仿相，置冰箱内备用。

2. 脂质的分离鉴定（薄层层析法TLC）

（1）硅胶H薄层的制备。

将经95%乙醇擦净过的3 mm×35 mm×100 mm层析玻璃置于水平台上，然后称取精制硅胶H 3.0 g置于25 mL烧杯内，加入0.1%碳酸氢钠约8 mL，调成具有一定稠度和流动性的胶浆。用10 mL量筒量取浆液3 mL，迅速小心流铺在层析板上（注意板面厚度均匀，切勿使浆液溢出板外），铺毕后继续水平静置0.5～1 h，使硅胶充分沉固，薄层表面凝成膜状。然后将层析板移入烘箱内水平位置，40 °C干燥至硅胶薄层发白。

（2）薄层活化。(www.daowen.com)

升高烘箱温度，使薄层充分干燥，此过程称为活化。为防止薄层表面起泡，应首先于80 °C左右烘20 min左右，然后升温至120 °C再烘2 h，活化完毕小心取出置于干燥器内冷却至室温。

（3）点样。

将活化的硅胶薄板从干燥器内取出放妥后，立即在距底边2～3 cm处中央，用内径0.5 mm点样毛细管吸取脂质混合液，分三次在同一点上点入薄层。点样直径不超过2～3 mm，每点一次待近干后再点下一次（小心勿损坏薄层胶面）。

（4）平衡和展开。

将洁净层析缸一端垫起，使其倾斜成150°左右，然后沿低端的缸内壁加入一定量的展开试剂。将点好样的薄板小心安放在缸内，近点样的一头搁在缸底高的无展开剂侵入的一端，另一端靠在缸内壁或玻架上。将薄板位置调整稳妥后，加盖封闭平衡约2 h。

平衡结束后，仍保持层析缸封闭状态，将缸底一端的展开剂倾斜流向另一端，层析板硅胶浸入展开剂中，展开开始。待展开剂上行至层析板上端1～1.5 cm处，展开停止，开盖取出薄板晾干。

（5）显色。

将展开晾干的薄板置于碘蒸气缸内熏蒸，30 min后即渐见黄色斑点显出，数小时后，斑点更明显。展层结果通常出现5～6个分离斑点。描出实验图谱，如图4-2所示。

图4-2　脂质薄层层析示意图

1—磷脂；2—鞘磷脂；3—丝氨酸磷脂；4—脑磷脂；5—物质性质不明确；6—中性脂质。

【注意事项】

（1）制板时要求薄层平滑均匀，无裂缝。

（2）点样时不要刺破薄板。

（3）点样管切勿弄混。

【讨论与思考】

（1）在混合物薄层色谱中，如何判定各组分在薄层上的位置。

（2）展开剂的高度若超过了点样线，对薄层色谱有何影响？

（3）点样时，样点太靠近薄板的边缘，展开时，会出现什么样的情况？

（4）在薄层色谱法中的展开中有哪些方法？展开过程中应注意些什么？

（5）点样时要注意写些什么？在展开时如何防止拖尾及前倾？