根据离心原理,按照实际工作的需要,目前可设计出各种离心方法,综合起来可分三类:
(一)平衡离心法
根据粒子大小、形状不同进行分离,包括差速离心法(Differential velocity centrifugation)和速率区带离心法(Rate zonal centrifugation)。
1. 差速离心法
(1)基本原理:它利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别,在同一离心条件下,沉降速度不同,通过不断增加相对离心力,使得非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分步沉淀。操作过程中一般是离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开,然后将上清液加高转速离心,分离出第二部分沉淀,如此往复加高转速,逐级分离出所需要的物质。差速离心的分辨率不高,沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开,常用于其他分离手段之前的粗制品提取。
(2)注意点:可用角式、水平式转头;可用刹车;难以获得高纯度。例如,用差速离心法分离已破碎的细胞各组分。
2. 速率区带离心法
(1)基本原理:离心前在离心管内先装入密度梯度介质(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等),待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间,同梯度液一起离心。离心后在近旋转轴处的介质密度最小,离旋转轴最远处介质的密度最大,但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度。这种方法是根据分离的粒子其在梯度液中沉降速度的不同,使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带,达到彼此分离的目的。
梯度液在离心过程中以及离心完毕后,取样时起着支持介质和稳定剂的作用,避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。该离心法的离心时间要严格控制,既要有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带,又要控制在任意一个粒子达到沉淀前。如果离心时间过长,所有的样品可全部到达离心管底部;离心时间不足,样品还没有分离。由于此法是一种不完全的沉降,沉降受物质本身大小的影响较大,一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。(www.daowen.com)
(2)注意点:严格控制离心时间;粒子密度大于介质密度;样品事先配制在较平缓的连续密度的梯度溶液;不能用角式转头、只能用水平式转头;不能用刹车。
(二)等密度离心法(Isopynic centrifugation)
等密度离心法又称等比重离心法,根据粒子密度差进行分离,等密度离心法和上述速率区带离心法合称为密度梯度离心法。
(1)基本原理:在离心前预先配制介质的密度梯度,此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度,待分离的样品铺在梯度液顶部或和梯度液先混合,离心开始后,当梯度液由于离心力的作用逐渐形成管底浓而管顶稀的密度梯度,与此同时原来分布均匀粒子也发生重新分布。当管底介质的密度大于粒子的密度,粒子上浮;在弯管顶处粒子密度大于介质密度时,则粒子沉降,最后粒子进入一个它本身的密度位置即粒子密度等于介质密度,此时粒子速度为零,不再移动,粒子形成纯组分的区带,与样品粒子的密度有关,而与粒子的大小和其他参数无关,因此只要转速、温度不变,则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。
(2)注意点:离心时间要长;可用角式转头或水平式转头;粒子密度相近或相等时不宜用;密度梯度溶液中要包含所有粒子密度;不能用刹车。
(三)经典式沉降平衡离心法
用于对生物大分子分子量的测定、纯度估计、构象变化。
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