层析根据不同的标准可以分为多种类型。

（一）按固定相基质的形式分

层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。纸层析是指以滤纸作为基质的层析。薄层层析是将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成一薄层，在薄层上进行层析。柱层析则是指将基质填装在管中形成柱形，在柱中进行层析。纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。

（二）按流动相的形式分

层析可以分为气相层析和液相层析。气相层析是指流动相为气体的层析，而液相层析指流动相为液体的层析。气相层析测定样品时需要气化，大大限制了其在生物化学领域的应用，主要用于氨基酸、核酸、糖类、脂肪酸等小分子的分析鉴定。而液相层析是生物领域最常用的层析形式，适于生物样品的分析、分离。

（三）按分离的原理不同分

层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。

1. 吸附层析

以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术。

2. 分配层析

根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。

3. 凝胶过滤层析（分子筛）

指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分类的技术。

（1）基本原理。

凝胶过滤层析的固定相是凝胶。凝胶是一种不带电荷的具有三维空间多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒内部都具有很多细微的小孔，如同筛子一样，如图1-1所示。凝胶特点：不带电荷，三维结构，细微多孔呈网状。

图1-1　凝胶层析的原理

常用凝胶有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶等。

葡聚糖凝胶介质是由多聚葡聚糖与环氧绿丙烷交联而成。最常用的葡聚糖凝胶层析介质是Sephadex G系列，不同型号的凝胶用G表示，G代表交联度，从G-10到G-100。“G”后面的数字表示每10 g干胶的吸水量，可根据待分离混合物分子量大小选用不同“G”值的凝胶。

（2）分离过程。

小分子物质→凝胶内部→进出，流程长→V下降→后流出大分子物质→不进入孔内部，只在颗粒间移动→流程短，先流出。分子量大小不同的物质因此得以分离。(www.daowen.com)

（3）影响凝胶层析的主要因素。

① 层析柱的选择与装填：层析柱的大小应根据分离样品量的多少及对分辨率的要求而定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。

② 流动相-洗脱液的选择：是含有一定浓度盐的缓冲液，目的是防止凝胶可能有吸附作用。其选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解洗脱物质，并不使其变性的缓冲液都可用于凝胶层析。

③ 加样量：加样量的多少应根据具体的实验而定。一般分级分离时加样量约为凝胶柱床体积的1%～5%，而分组分离时加样量约为凝胶柱床体积的10%～25%。

④ 凝胶再生：葡聚糖凝胶再生使用NaOH（0.2 mol/L）和NaCl（0.5 mol/L）合液处理。

4. 离子交换层析

利用离子交换剂对需要分离的各种离子具有不同的亲和力（静电引力）而达到分离目的的层析技术。

（1）离子交换层析的固定相是离子交换剂，流动相是具有一定pH和一定离子强度的电解质溶液。

（2）离子交换剂是具有酸性或碱性基团的不溶性高分子化合物，这些带电荷的酸性或碱性基团与其母体以共价键相连，这些基团所吸引的阳离子或阴离子可以与水溶液中的阳离子或阴离子进行可逆的交换。因此根据可交换离子的性质将离子交换剂分为两大类：阳离子交换剂和阴离子交换剂。

（3）据离子交换剂的化学本质，可将其分为离子交换树脂、离子交换纤维素和离子交换葡聚糖等多种。

① 离子交换树脂是人工合成的高分子化合物，生化实验中所用的离子交换树脂多为交联聚苯乙烯衍生物。离子交换树脂多用于样品去离子，从废液中回收所需的离子和水的处理等。由于它可使不稳定的生物大分子变性，因此不适用于对生物样品进行分离。

② 离子交换纤维素可用于生物大分子的分离。其缺点是分子形态不规则，孔隙不均一，对要求非常严格的试验尚不能达到要求。较为理想的离子交换剂是离子交换葡聚糖凝胶和离子交换琼脂糖凝胶。它们具有颗粒整齐，孔径均一等优点，往往得到较好的分离效果。

（4）根据各种离子交换剂所带酸性和碱性功能团的不同和其解离能力的差异，各种交换剂又可进一步分为强酸型、弱酸型、强碱型和弱碱型四种。

凝胶层析

（5）离子交换层析的基本过程是：离子交换剂经适当处理、装柱后，应该先用酸或碱处理（视具体情况可用一定pH的缓冲液处理），使离子交换剂变成相应的离子型（阳离子交换剂带负电并吸引相反离子H+，阴离子交换剂带正电并吸引相反离子OH-）。加入样品后，使样品与交换剂所吸引的相反离子（H+或OH-）进行交换，样品中待分离物质便通过电价键吸附于离子交换剂上面。然后用不会改变交换剂对样品离子亲和状态的溶液（如起始缓冲液）充分冲洗，使未吸附的物质洗出。洗脱待分离物质时常用的两种方法，一是制作电解质浓度梯度，即离子强度梯度。通过不断增加离子度使吸附到交换剂上的物质根据其静电引力的大小而不断竞争性的解脱下来；二是制作pH梯度，影响样品电离能力，也使交换剂与样品离子亲和力下降，当pH梯度接近各样品离子的等电点时，该离子就被解脱下来。在实际工作中，离子强度梯度和pH梯度可以是连续的（称梯度洗脱），也可以是不连续的（称阶段洗脱）。一般来讲，前者分离的效果比后者的分离效果理想，梯度洗脱需要梯度混合器来制造离子强度梯度或pH梯度。最简单的梯度混合器，它由两个容器组成，两容器之间以连通管相连接，与出口连接的容器装有搅拌装置，内盛起始洗脱液，此洗脱液代表开始洗脱的离子强度（或起始pH）；另一容器内盛有终末洗脱液，此洗脱液代表洗脱的最后离子强度（或最后pH）。在洗脱过程中，由于终末洗脱液不断进入起始洗脱液中，并不断被搅拌均匀，所以流出的洗脱液成分不断的由起始状态向终末状态演变形成连续的梯度变化。

5. 亲和层析

亲和层析法是近年来被广为重视并得到迅速发展的提纯、分离方法之一。许多物质都具有和某化合物发生特异性可逆结合的特性。例如：酶与辅酶或酶与底物（产物或竞争性抑制剂等），抗原与抗体，凝集素与受体，维生素与结合蛋白，凝集素与多糖（或糖蛋白、细胞表面受体），核酸与互补链（或组蛋白、核酸多聚酶、结合蛋白）以及细胞与细胞表面特异蛋白（或凝集素）等。亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的。

亲和层析由于配体与待分离物质进行特异性结合，所以分离提纯的效率极高，提纯度可达几千倍，是当前最为理想的提纯方法。亲和层析配体与待分离物质特异性结合性质还可用来从变性的样品中提纯出其中未变性部分，从大量污染的物质中提纯小量所需成分。亲和层析还可用来从极度稀薄的液体中浓缩其溶质。亲和层析所用的载体和凝胶过滤所要求的凝胶特性相同，即化学性质稳定，不带电荷，吸附能力弱，网状疏松，机械强度好，不易变形，保障流速的物质。聚丙烯酰胺凝胶颗粒、葡聚糖凝胶颗粒以及琼脂糖凝胶颗粒都可用，其中以琼脂糖凝胶（Sephadex 4B）型应用最广泛。亲和层析的关键是设法选择合适的配体并将此配体与载体化学连接起来，形成稳定的共价键，这需要在实际工作中根据需要加以选择和试验。