技能训练1. 水样悬浮物的测定——重量法

一、概述

1.含义及测定意义

水中悬浮物，简称SS（suspended substance），是指水样通过孔径为0.45 μm的滤膜，截留在滤膜上并于103～105 ℃烘干至恒重得到的固体物质。

悬浮物包括不溶于水的泥沙、各种污染物、微生物以及难溶无机物等。地表水中存在悬浮物使水体浑浊，降低透明度，影响水生生物的呼吸和代谢，甚至造成鱼类窒息死亡。悬浮物多时，还可能造成河道阻塞。造纸、制革、选矿、冲渣、喷淋除尘等工业操作中产生大量含无机、有机的悬浮物废水，因此，在水和废水处理中，测定悬浮物具有特定意义。

2.测定方法选择

水中悬浮物的测定方法为重量法（GB/T 11901-1989），该法适用于地面水、地下水、生活污水和工业废水中悬浮物的测定。

二、重量法

1.原理

悬浮固体系指剩留在滤料上并于103～105℃烘至恒重的固体。测定的方法是将水样通过滤料后，烘干固体残留物及滤料，将所称重量减去滤料重量，即为悬浮固体（总不可滤残渣）。

2.仪器

（1）烘箱。

（2）分析天平。

（3）干燥器。

（4）孔径为0.45 μm滤膜及相应的滤器或中速定量滤纸。

（5）玻璃漏斗。

（6）内径为30～50 mm称量瓶。

3.测定步骤

（1）将滤膜放在称量瓶中，打开瓶盖，在103～105℃烘干2 h，取出冷却后盖好瓶盖称重，直至恒重（两次称量相差不超过0.000 5 g）。

（2）去除漂浮物后振荡水样，量取均匀适量水样（使悬浮物大于2.5 mg），通过上面称至恒重的滤膜过滤；用蒸馏水洗残渣3～5次。如样品中含油脂，用10 ml石油醚分两次淋洗残渣。

（3）小心取下滤膜，放入原称量瓶内，在103～105 ℃烘箱中，打开瓶盖烘2 h，冷却后盖好盖称重，直至恒重为止。

4.计算

式中　A——悬浮固体+滤膜及称量瓶重（g）；

B——滤膜及称量瓶重（g）；

V——水样体积（ml）。

5.注意事项：

（1）树叶、木棒、水草等杂质应先从水中除去。

（2）废水黏度高时，可加2～4倍蒸馏水稀释，振荡均匀，待沉淀物下降后再过滤。

（3）也可采用石棉坩埚进行过滤。

三、思考题

1.悬浮物是指什么？

2.重量法测定悬浮物的原理是什么？

3.测定水中悬浮物过程中烘箱的温度是否可以改变？

技能训练2. 水样氨氮的测定——纳氏试剂分光光度法

一、概述

1.危害及来源

氨氮（NH3-N）是指水中以游离氨（NH3）或铵盐（NH4+）形式存在的氮。两者的组成比取决于水体的pH值和水温。当pH值偏高时，游离氨比例较高，反之铵盐比例较高，水温则相反。鱼类对水中氨氮比较敏感，当氨氮含量高时会导致鱼类死亡，对其他水生生物也有不同程度的危害。

水中氨氮主要来源于生活污水中含氮有机物受微生物作用的分解产物以及某些工业污水（如焦化污水、合成氨化肥厂污水等）和农田排水。

2.测定方法选择

氨氮的测定方法有蒸馏-中和滴定法（HJ 537-2009）。纳氏试剂分光光度法（HJ 535-2009）、水杨酸分光光度法（HJ 536-2009）、气相分子吸收光谱法（HJ/T 195-2005）等。

此外还有流动注射-水杨酸分光光度法（HJ 666-2013）、连续流动-水杨酸分光光度法（HJ 665-2013），这两类方法均适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中氨氮的测定，需分别使用专用的流动注射分析仪和连续流动分析仪测定。

蒸馏-中和滴定法适用于生活污水和工业污水中氨氮的测定。当试样体积为250 ml时，本方法的检出限为0.05 mg/L（以N计）。

纳氏试剂分光光度法适用于地表水、地下水、生活污水和工业污水中氨氮的测定。样品经预处理后，用一组50 ml比色管进行显色测定，具有操作简单、灵敏的特点。

水杨酸分光光度法也适用于地下水、地表水、生活污水和工业污水中氨氮的测定。样品经预处理后，用一组10 ml比色管进行显色测定，所用试剂较多，显色时间比较长（达60 min），操作费时。

气相分子吸收法适用于地表水、地下水、海水、饮用水、生活污水和工业污水中氨氮的测定。方法的最低检出限为0.020 mg/L，测定下限为0.080 mg/L，测定上限为100 mg/L，需使用专用的气相分子吸收光谱仪进行分析测定。

下面介绍最常用的蒸馏-中和滴定法和纳氏试剂分光光度法。

二、纳氏试剂分光光度法

1.实训目的

（1）测定水中氨氮的含量。

（2）掌握分光光度计的分析方法。

2.方法原理

以游离态的氨或铵离子等形式存在的氨氮与纳氏试剂反应生成淡红棕色络合物，该络合物的吸光度与氨氮含量成正比，于波长420 nm处测量吸光度。

3.方法的适用范围

测定水中氨氮的纳氏试剂分光光度法。本方法适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中氨氮的测定。当水样体积为50 ml，使用20 mm比色皿时，本方法的检出限为 0.025 mg/L，测定下限为0.10 mg/L，测定上限为2.0 mg/L（均以N计）。

4.干扰及消除

水样中含有悬浮物、余氯、钙镁等金属离子、硫化物和有机物时会产生干扰，含有此类物质时要作适当处理，以消除对测定的影响。若样品中存在余氯，可加入适量的硫代硫酸钠溶液去除，用淀粉-碘化钾试纸检验余氯是否除尽。在显色时加入适量的酒石酸钾钠溶液，可消除钙镁等金属离子的干扰。若水样浑浊或有颜色时可用预蒸馏法或絮凝沉淀法处理。

5.仪器与试剂

（1）仪器

①可见分光光度计：具20 mm比色皿。

②氨氮蒸馏装置：由500 ml 凯式烧瓶、氮球、直形冷凝管和导管组成，冷凝管末端可连接一段适当长度的滴管，使出口尖端浸入吸收液液面下。亦可使用500 ml蒸馏烧瓶。

（2）试剂

①无氨水可选用下列方法之一进行制备：

蒸馏法：每升蒸馏水中加0.1 ml硫酸，在全玻璃蒸馏器中重蒸馏，弃去50 ml初馏液，按取其余馏出液于具塞磨口的玻璃瓶中，密塞保存。

离子交换法：使蒸馏水通过强酸型阳离子交换树脂柱。

②1 mol/L盐酸溶液、1 mol/L氢氧化钠溶液。

③轻质氧化镁（MgO）：将氧化镁在500℃下加热，以出去碳酸盐。

④0.05%溴百里酚蓝指示液：pH值6.0～7.6。

⑤防沫剂，如石蜡碎片。

⑥吸收液的制备：

硼酸溶液：称取20 g硼酸溶于水，稀释至 1 L。

0.01 mol/L硫酸溶液。

⑦纳氏试剂：可选择下列方法之一制备。

称取20 g碘化钾溶于约100 ml水中，边搅拌边分次少量加入氯化汞（HgCl2）结晶粉末（约10 g），至出现朱红色沉淀不易溶解时，改写滴加饱和氯化汞溶液，并充分搅拌，当出现微量朱红色沉淀不再溶解时，停止滴加氯化汞溶液。另称取60 g氢氧化钾溶于水，并稀释至250 ml，冷却至室温后，将上述溶液徐徐注入氢氧化钾溶液中，用水稀释至400 ml，混匀静置过夜将上清液移入聚乙烯瓶中，密塞保存。

称取16 g氢氧化钠，溶于50 ml水中，充分冷却至室温。另称取7 g碘化钾和碘化汞（HgI2）溶于水，然后将此溶液在搅拌下徐徐注入氢氧化钠溶液中，用水稀释至100 ml，贮于聚乙烯瓶中，密塞保存。

⑧酒石酸钾钠溶液：称取50 g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O）溶于100 ml水中，加热煮沸以除去氨，放冷，定容至100 ml。

⑨铵标准贮备溶液：称取3.819 g经100℃干燥过的优级纯氯化铵（NH4Cl）溶于水中，移入1 000 ml容量瓶中，稀释至标线。此溶液每毫升含1.00 mg氨氮。

⑩铵标准使用溶液：移取5.00 ml铵标准贮备液于500 ml容量瓶中，用水稀释至标线。此溶液每毫升含0.010 mg氨氮。

6.实训内容

（1）水样预处理：取250 ml水样（如氨氮含量较高，可取适量并加水至250 ml，使氨氮含量不超过2.5 mg），移入凯氏烧瓶中，家数滴溴百里酚蓝指示液，用氢氧化钠溶液或演算溶液调节至pH值7左右加入0.25 g轻质氧化镁和数粒玻璃珠，立即连接氮球和冷凝管，导管下端插入吸收液液面下。加热蒸馏，至馏出液达200 ml时，停止蒸馏，定容至250 ml。采用酸滴定法或纳氏比色法时，以50 ml硼酸溶液为吸收液；采用水杨酸-次氯酸盐比色法时，改用50 ml 0.01 mol/L硫酸溶液为吸收液。

（2）标准曲线的绘制：吸取0，0.50，1.00，3.00，7.00和10.0 ml铵标准使用液分别于50 ml比色管中，加水至标线，家1.0 ml酒石酸钾溶液，混匀加1.5 ml纳氏试剂，混匀.放置10 min后，在波长420 nm处，用光程20 mm比色皿，以水为参比，测定吸光度。由测得的吸光度，减去零浓度空白管的吸光度后，得到校正吸光度，绘制以氨氮含量（mg）对校正吸光度的标准曲线。

（3）水样的测定：

①分取适量经絮凝沉淀预处理后的水样（使氨氮含量不超过0.1 mg），加入50 ml比色管中，稀释至标线，加0.1 ml酒石酸钾钠溶液。以下同标准曲线的绘制。

②分取适量经蒸馏预处理后的馏出液，加入50 ml比色管中，加一定量1 mol/L氢氧化钠溶液，以中和硼酸，稀释至标线。加1.5 ml纳氏试剂，混匀放置10 min后，同标准曲线步骤测量吸光度。

（4）空白实验：以无氨水代替水样，做全程序空白测定。

7.数据处理

（1）测定结果记录（数据表格）

（2）计算

由水样测得的吸光度减去空白实验的吸光度后，从标准曲线上查得氨氮量（mg）后，按下式计算：

式中　m——由标准曲线查得的氨氮量，mg；

V——水样体积，ml

8.注意事项

（1）纳氏试剂中碘化汞与碘化钾的比例，对显色反应的灵敏度有较大影响.静置后生成的沉淀应除去。

（2）滤纸中常含痕量铵盐，使用时注意用无氨水洗涤，所用玻璃皿应避免实验室空气中氨的玷污。

三、蒸馏-中和滴定法

1.原理

滴定法仅适用于已进行蒸馏预处理的水样。调节水样至pH值在6.0～7.4范围，加入氧化镁使呈微碱性。加热蒸馏，释出的氨被吸收入硼酸溶液中，以甲基红-亚甲蓝为指示剂，用酸标准溶液滴定馏出液中的铵。

当水样中含有在此条件下，可被蒸馏出并在滴定时能与酸反应的物质，如挥发性胺类等，则将使测定结果偏高。

2.试剂

（1）混合指示液：称取200 mg甲基红溶于100 ml95%乙醇，另称取100 mg亚甲蓝溶于50 ml95%乙醇，以两份甲基红溶液与一份亚甲蓝溶液混合后备用。混合液一个月配制一次。

（2）硫酸标准溶液：分取5.6 ml（1+9）硫酸溶液于1 000 ml容量瓶中，稀释至标线，混匀。按下列操作进行标定。称取180℃干燥2 h的基准试剂级无水碳酸钠（Na2CO3）约0.5 g（称准至0.000 1 g），溶于新煮沸放冷的水中，移入500 ml容量瓶中，加25 ml水，加1滴0.05%甲基橙指示液，用硫酸溶液滴定至淡橙红色止。记录用量，用下式计算硫酸溶液的浓度。

式中　W——碳酸钠的重量（g）；

V——消耗硫酸溶液的体积（ml）。

（3）0.05%甲基橙指示液。

3.测定步骤

（1）水样预处理：同纳氏比色法。

（2）水样的测定：向硼酸溶液吸收的、经预处理后的水样中，加2滴混合指示液，用0.020 mol/L硫酸溶液滴定至绿色转变成淡紫色止，记录硫酸溶液的用量。

（3）空白试验：以无氨水代替水样，同水样全程序步骤进行测定。

4.计算

式中　A——滴定水样时消耗硫酸溶液体积（ml）；

B——空白试验消耗硫酸溶液体积（ml）；

M——硫酸溶液浓度（mol/L）；

V——水样体积（ml）；

14——氨氮（N）摩尔质量。

四、思考题

1.纳氏试剂比色法测定水中氨氮含量的原理是什么？

2.测定氨氮时哪些物质会有干扰？如何消除？

3.样品蒸馏前pH值调节对测定结果有什么影响？

技能训练3. 水样总氮的测定——过硫酸钾消解紫外分光光度法

一、概述

1.含义及来源

总氮是指在规定的测定条件下，样品中能测定的溶解态氮及悬浮物中氮的总和，包括亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、无机铵盐、溶解态氨以及大部分有机含氮化合物中的氮，水中的氮通过生物化学作用可以互相转化。大量生活污水、农田排水或含氮工业废水排入水体，使水中有机氮和各种无机氮化物含量增加，水体呈现富营养化状态，生物和微生物大量繁殖，消耗水中溶解氧，使水质恶化。因此，总氮是衡量水质的重要指标之一。

2.测定方法选择

总氮测定方法有碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法（HJ 636-2012）、流动注射-盐酸萘乙二胺分光光度法（HJ 668-2013）、连续流动-盐酸萘乙二胺分光光度法（HJ 667-2013）和气相分子吸收光谱法（HJ/T 199-2005）等，以上方法均适用于地表水、地下水、工业废水和生活污水中总氮的测定。

碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法为实验室常用测定方法，仪器设备相对较简单；流动注射-盐酸萘乙二胺分光光度法和连续流动-盐酸萘乙二胺分光光度法需分别使用专用的流动注射分析仪和连续流动分析仪等仪器测定。

这里重点介绍常用的过硫酸钾消解紫外分光光度法（HJ 636-2012）。

二、过硫酸钾消解紫外分光光度法

1.方法原理

在60℃以上的水溶液中过硫酸钾按如下反应式分解，生成氢离子和氧。

加入氢氧化钠用以中和氢离子，使过硫酸钾分解完全。在120～124℃的碱性介质条件下，压过硫酸钾作氧化剂，不仅可将水样中的氨氮和亚硝酸盐氮氧化为硝酸盐，同时将水样中大部分有机氮化合物氧化为硝酸盐。而后，用紫外分光光度法分别于波长220 nm与275 nm处测定其吸光度，按A=A220-2A275计算硝酸盐氮的吸光度值，从而计算总氮的含量。其摩尔吸光系数为1.47×103 L/（mol*cm）。

2.干扰及消除

（1）水样中含有六价铬离子及三价铁离子时，可加入5%盐酸羟胺溶液1～2 ml以消除其对测定的影响。

（2）碘离子及溴离了对测定有干扰。测定20 μg硝酸盐氮时，碘离子含量相对于总氮含量的0.2倍时无干扰；溴离子含量相对于总氮含量的3.4倍时无干扰。

（3）碳酸盐及碳酸氢盐对测定的影响，在加入一定量的盐酸后可消除。

（4）硫酸盐及氯化物对测定无影响。

3.适用范围

该法主要适用于湖泊、水库、江河水中总氮的测定。方法检测下限为0.05 mg/L，上限为4 mg/L。

4.仪器

（1）紫外分光光度计；

（2）压力蒸汽消毒器或民用压力锅，压力为1.1～1.3 kg/cm2，相应温度为120～124℃；

（3）25 ml具塞玻璃磨口比色管。

5.试剂

（1）无氨水：每升水中加入0.1 ml浓硫酸，蒸馏。收集馏出液于玻璃容器中或用新制备的去离了水。

（2）20%氢氧化钠溶液：称取20 g氢氧化钠，溶于无氨水中，稀释至100 ml。

（3）碱性过硫酸钾溶液：称取40 g过硫酸钾（K2S2O8），15 g氢氧化钠，溶于无氨水中，稀释至1 000 ml。溶液存放在聚乙烯瓶内，可贮存一周。

（4）（1+9）盐酸。

（5）硝酸钾标准溶液：

①标准贮备液：称取0.721 8 g经105～110 ℃烘干4 h的优级纯硝酸钾（KNO3）溶于无氨水中，移至1 000 ml容量瓶中定容。此溶液每毫升含100 μg硝酸盐氮。加入2 ml三氯甲烷为保护剂，至少可稳定6个月。

②硝酸钾标准使用液：将贮备液用无氨水稀释10倍而得，此溶液每毫升含10 μg硝酸盐氮。

6.步骤

（1）校准曲线的绘制

①分别吸取0、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00、7.00、8.00 ml硝酸钾标准使用溶液于25 ml比色管中，用无氨水稀释至10 ml标线。

②加入5 ml碱性过硫酸钾溶液，塞紧磨口塞，用纱布及纱绳裹紧管塞，以防迸溅出。

③将比色终置于压力蒸汽消毒器中，加热0.5 h，放气使压力指针回零。然后升温至120℃～124℃开始计时（或将比色管置于民用压力锅中，加热至顶压溉吹气开始计时），使比色管在过热水蒸气中加热0.5 h。

④自然冷却，开阀放气，移去外盖，取出比色管并冷至室温。

⑤加入（1+9）盐酸1 ml，用无氨水稀释至25 ml标线。

⑥在紫外分光光度计上，以无氨水作参比，用10 mm石英比色皿分别在220 nm及275 nm波长处测定吸光度。用校正的吸光度绘制校准曲线。

（2）样品测定步骤

取10 ml水样，或取适量水样（使氮含量为20～80 μg）。按校准曲线绘制步骤②至⑥操作。然后按校正吸光度，在校准曲线上查出相应的总氮量，再用下列公式计算总氮含量：

式中　m——从校准曲线上查得的含氮量（μg）；

V——所取水样体积（ml）。

7.精密度和准确度

（1）21个实验室对两种含总氮1.15～2.64 mg/L的统一样品进行了测定，室内相对标准偏差为1.6%～2.5%；空间相对标准偏差为1.9%～4.9%。

（2）21个实验室，共测定64种水样（水库、湖水、河水等地表水55种，井水两种，废水七种）。每种水样重复测定六次。相对标准偏差一般小于5%，最大为7%；平均回收率在95%～105%之间，仅两种水样回收率为90%。

8.注意事项

（1）参考吸光度比值A275/A220×100%大于20%时，应予鉴别（参见硝酸盐氮测定中的紫外分光光度法）。

（2）玻璃具塞比色管的密合性应良好。使用压力蒸汽消毒器时，冷却后放气要缓慢；使用民用压力锅时，要充分冷却方可揭开锅盖，以免比色管塞蹦出。

（3）玻璃器皿可用10%盐酸浸洗，用蒸馏水冲洗后再用无氨水冲洗。

（4）使用高压蒸汽消毒器时，应定期校核压力表：使用民用压力锅时，应检查橡胶密封圈，使不致漏气而减压。

（5）测定悬浮物较多的水样时，在过硫酸钾氧化后可能出现沉淀。遇此情况，可吸取氧化后的上清液进行紫外分光光度法测定。

三、思考题

1.样品消解和测定时应注意哪些问题？

2.总氮测定的质量保证和控制措施有哪些？

技能训练4. 水样总磷的测定——过硫酸钾消解-钼酸铵分光光度法

一、概述

1.含义及测定意义

在天然水和废水中，磷几乎都以各种磷酸盐的形式存在，它们分为正磷酸盐、缩合磷酸盐（焦磷酸盐、偏磷酸盐和多磷酸盐）和有机结合的磷（如磷脂等），它们存在于溶液中、腐殖质粒子中或水生生物中。

总磷包括溶解的、颗粒的、有机磷和无机磷。地表水中氮、磷含量过高时（超过0.2 mg/L），水体呈现富营养化状态，微生物大量繁殖，浮游植物生长旺盛，水质恶化，如赤潮等，因此水体总磷含量是评价水质污染程度的重要指标之一。一般天然水中磷酸盐含量不高，地表水中的磷主要来源于化肥、冶炼、合成洗涤剂等行业的废水和生活污水。

2.测定方法选择

总磷测定常用的方法有过硫酸钾消解-钼酸铵分光光度法（GB/T 11893-1989），该法适用于地面水、污水及工业废水中总磷的测定。

此外，总磷的测定方法还有流动注射-钼酸铵分光光度法（HJ 671-2013），磷酸盐和总磷的测定有连续流动-钼酸铵分光光度法（HJ 670-2013），这两类方法需分别使用专用的流动注射分析仪和连续流动分析仪等仪器测定。

这里重点介绍实验室分析常用的过硫酸钾消解-钼酸铵分光光度法。

二、过硫酸钾消解-钼酸铵分光光度法

1.实训目的

（1）掌握总磷的测定方法与原理。

（2）了解水体中过量的磷对水环境的影响。

2.方法原理

在中性条件下用过硫酸钾（或硝酸－高氯酸）使试样消解，将所含磷全部氧化为正磷酸盐。在酸性介质中，正磷酸盐与钼酸铵反应，在锑盐存在下生成磷钼杂多酸后，立即被抗坏血酸还原，生成蓝色的络合物。

总磷包括溶解的、颗粒的、有机的和无机磷。本标准适用于地面水、污水和工业废水。取25 ml水样，本标准的最低检出浓度为0.01 mg/L，测定上限为0.6 mg/L。在酸性条件下，砷、铬、硫干扰测定。

3.方法的适用范围

适用于地面水、地下水的测定。本法可测定水中亚硝酸盐氮、硝酸盐氨、无机铵盐、溶解态氨及大部分有机含氮化合物中氮的总和。

4.干扰及消除

测定中干扰物主要是碘离子与溴离子，碘离子相对于总氮含量的2.2倍以上，溴离子相对于总氮含量的3.4倍以上有干扰。

某些有机物在本法规定的测定条件下不能完全转化为硝酸盐时对测定有影响。

5.仪器与试剂

（1）仪器

①手提式蒸汽消毒器或一般压力锅（1.1～1.4 kg/cm2）。

②50 ml比色管。

③分光光度计。

注：所有玻璃器皿均应用稀盐酸或稀硝酸浸泡。

（2）试剂

①硫酸，密度为1.84 g/ml。

②高氯酸，优级纯，密度为1.68 g/ml。

③硫酸，约0.5 mol/L，将27 ml硫酸加入到973 ml水中。

④1 mol/L氢氧化钠溶液，将40 g氢氧化钠溶于水并稀释至1 000 ml。6 mol/L氢氧化钠溶液，将240 g氢氧化钠溶于水并稀释至1 000 ml。

⑤过硫酸钾溶液，50 g/L，将5 g过硫酸钾（K2S2O8）溶于水，并稀释至100 ml。

⑥抗坏血酸溶液，100 g/L，将10 g抗坏血酸溶于水中，并稀释至100 ml。此溶液贮于棕色的试剂瓶中，在冷处可稳定几周，如不变色可长时间使用。

⑦钼酸盐溶液：将13 g钼酸铵[（NH4）6MO7O24·4H2O]溶于100 ml水中，将0.35 g酒石酸锑钾[KSbC4HO7·0.5H2O]溶于100 ml水中。在不断搅拌下分别把上述钼酸铵溶液、酒石酸锑钾溶液徐徐加到300 ml硫酸中，混合均匀。此溶液贮存于棕色瓶中，在冷处可保存三个月。

⑧磷标准贮备溶液，称取0.219 7 g于110 ℃干燥2 h在干燥器中放冷的磷酸二氢钾（KH2PO4），用水溶解后转移到1 000 ml容量瓶中，加入大约800 ml水，加5 ml硫酸，然后用水稀释至标线，混匀。1.00 ml此标准溶液含50.0 g磷。本溶液在玻璃瓶中可贮存至少六个月。

⑨磷标准使用溶液，将10.00 ml磷标准贮备溶液转移至250 ml容量瓶中，用水稀释至标线并混匀。1.00 ml此标准溶液含2.0 g磷。使用当天配制。

⑩浊度—色度补偿液，混合二体积硫酸和一体积抗坏血酸。使用当天配制。酚酞溶液，10 g/L，将0.5 g酚酞溶于50 ml95%的乙醇中。

6.实训内容

（1）空白试样

按规定进行空白试验，用蒸馏水代替试样，并加入与测定时相同体积的试剂。

（2）测定

①消解

过硫酸钾消解：向试样中加4 ml过硫酸钾，将比色管的盖塞紧后，用一小块布和线将玻璃塞扎紧，放在大烧杯中置于高压蒸汽消毒器中加热，待压力达1.1 kg/cm2，相应温度为120℃时、保持30 min后停止加热。待压力表读数降至零后，取出放冷。然后用水稀释至标线。

注：如用硫酸保存水样。当用过硫酸钾消解时，需先将试样调至中性。若用过硫酸钾消解不完全，则用硝酸－高氯酸消解。

硝酸—高氯酸消解：取25 ml试样于锥形瓶中，加数粒玻璃珠，加2 ml硝酸在电热板上加热浓缩至10 ml。冷后加5 ml硝酸，再加热浓缩至10 ml，冷却。再后加3 ml高氯酸，加热至高氯酸冒白烟，此时可在锥形瓶上加小漏斗或调节电热板温度，使消解液在瓶内壁保持回流状态，直至剩下3～4 ml，冷却。加水10 ml，加1滴酚酞指示剂，滴加氢氧化钠溶液至刚好呈微红色，再滴加硫酸溶液使微红刚好退去，充分混匀，移至具塞刻度管中，用水稀释至标线。

注：a.用硝酸-高氯酸消解需要在通风橱中进行。高氯酸和有机物的混合物经加热易发生危险，需将试样先用硝酸消解，然后再加入高氯酸消解。

b.绝不可把消解的试样蒸干。

c.如消解后有残渣时，用滤纸过滤于具塞比色管中。

d.水样中的有机物用过硫酸钾氧化不能完全破坏时，可用此法消解。

②发色

分别向各份消解液中加入1 ml抗坏血酸溶液混匀，30 s后加2 ml钼酸盐溶液充分混匀。

注：a.如试样中含有浊度或色度时，需配制一个空白试样（消解后用水稀释至标线），然后向试料中加入3 ml浊度-色度补偿液，但不加抗坏血酸溶液和钼酸盐溶液。然后从试料的吸光度中扣除空白试料的吸光度。

b.砷大于2 mg/L干扰测定，用硫代硫酸钠去除。硫化物大于2 mg/L干扰测定，通氮气去除。铬大于50 mg/L干扰测定，用亚硫酸钠去除。

③分光光度测量

室温下放置15 min后，使用光程为30 mm比色皿，在700 nm波长下，以水做参比，测定吸光度。扣除空白试验的吸光度后，从工作曲线上查得磷的含量。

注：如显色时室温低于13℃，可在20～30℃水浴上显色15 min即可。

④工作曲线的绘制

取7支具塞比色管分别加入0.0、0.50 ml、1.00 ml、3.00 ml、5.00 ml、10.0 ml、15.0 ml磷酸盐标准使用溶液。加水至25 ml。然后按测定步骤进行处理。以水做参比，测定吸光度。扣除空白试验的吸光度后，和对应的磷的含量绘制工作曲线。

7.数据处理

（1）测定结果记录

（2）计算

总磷含量以C（mg/L）表示，按下式计算：

式中　m——试样测得含磷量，g；

V——测定用试样体积，ml。

8.注意事项

（1）如试样中色度影响测量吸光度时，需做补偿校正。在50 ml比色管中，分取与样品测定相同量的水样，定容后加入3 ml浊度补偿液，测量吸光度，然后从水样的吸光度中减去校正吸光度。

（2）室温低于13℃时，可在20～30℃水浴中显色15 min。

（3）操作所用的玻璃器皿，可用1+5盐酸浸泡2 h，或用不含磷酸盐的洗涤剂洗刷。

（4）比色皿用后应以稀硝酸或铬酸洗液浸泡片刻，以除去吸附的钼蓝有色物。

三、思考题

1.在测定总磷过程中过硫酸钾的作用是什么？

2.影响总磷测定的因素有哪些？如何避免？

技能训练5. 水样化学需氧量的测定——重铬酸钾法

一、概述

1.含义及测定意义

化学需氧量，简称CODCr（chemical oxygen demand），反映水体受还原性物质主要是有机物污染的程度，具体是指在一定条件下，氧化1 L水样中还原性物质所消耗强氧化剂重铬酸钾的量，换算为氧量，以O2的mg/L表示，CODCr可简写为COD。

水中还原性物质既包括有机物，也包括无机物（如氯离子、亚硝酸盐、亚铁盐等），它们大多具有毒性，并能使水体中溶解氧减少，使水生生物窒息死亡，对生态系统产生严重影响，导致水质恶化。

化学需氧量高意味着水中含有大量还原性物质，水中的还原性物质有各种有机物、亚硝酸盐、硫化物、亚铁盐等。但主要的是有机物。因此，化学需氧量（COD）又往往作为衡量水中还原性有机物质含量多少的指标。化学需氧量越高，就表示水体的有机物污染越严重，这些有机物污染的来源可能是农药、化工厂、有机肥料等。如果不进行处理，许多有机污染物可在水体底部被底泥吸附而沉积下来，在今后若干年内对水生生物造成持久的毒害作用。在水生生物大量死亡后，河中的生态系统即被摧毁。人若以水中的生物为食，则会大量吸收这些生物体内的毒素，积累在体内，这些毒物常有致癌、致畸形、致突变的作用，对人极其危险。另外，若以受污染的江水进行灌溉，则植物、农作物也会受到影响，容易生长不良，而且人也不能取食这些作物。但化学需氧量高不一定就意味着有前述危害，具体判断要做详细分析，如分析有机物的种类，到底对水质和生态有何影响，是否对人体有害等。

化学需氧量是一个条件性指标，其测定结果随所用氧化剂的种类、浓度、反应温度和时间、反应液的酸度及催化剂有无等的变化而不同，因此必须严格按要求操作，测得结果才具有可比性。

COD是环境监测和水处理技术中一个非常重要的监测和控制指标，需要重点掌握。

2.方法选择

水中化学需氧量的测定方法有重铬酸盐法（GB 11914-1989）、快速消解分光光度法（HJ/T 399-2007）、氯气校正法（HJ/T 70-2001）和碘化钾碱性高锰酸钾法（HJ/T 132-2003）等。

重铬盐酸法适用于各种类型的含COD值大于30 mg/L的水样，测定上限为700 mg/L。本标准不适应与含氯化物浓度大于100 mg/L（稀释后）的含盐水。测定时使用0.025 mol/L的重铬酸钾标准溶液（对应使用浓度相应减倍的硫酸亚铁铵标准溶液），样品最低检出浓度为5 mg/L，测定上限为50 mg/L。

快速消解分光光度法适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中化学需氧量的测定。对未经稀释的水样，COD测定下限为50 mg/L，测定上限为1 000 mg/L，其氯离子浓度不应大于1 000 mg/L，如大于此值，可经适当稀释后进行测定。

氯气校正法（HJ/T 70-2001）适用于氯离子含量小于20 000 mg/L的高氯废水中COD的测定；碘化钾碱性高锰酸钾法适于测定油气田氯离子含量高达几万或十几万毫克每升高氯废水中的COD，方法的最低检出限位0.2 mg/L，测定上限为62.5 mg/L。

对于污废水，我国规定用重铬酸钾法测定其有机物量，本节重点介绍。

二、重铬酸钾法

1.方法原理

在强酸性溶液中，准确加入过量的K2Cr2O7标准溶液，密封催化微波消解，将水样中还原性物质（主要是有机物）氧化，过量的K2Cr2O7以试亚铁灵作指示剂，用硫酸亚铁铵标准溶液回滴，根据所消耗的K2Cr2O7标准溶液的量计算水样化学需氧量。反应式如下：

适用于各种类型的含COD值大于30 mg/L的水样，对未经稀释的水样的测定上限为700 mg/L。不适用于含氯化物浓度大于1 000 mg/L（稀释后）的含盐水。

2.仪器试剂

（1）回流装置：带有24号标准磨口的 250 ml 锥形瓶的全玻璃回流装置。回流冷凝管长度为300～500 mm。若取样量在 30 ml 以上，可采用带 500 ml 锥形瓶的全玻璃回流装置。

（2）加热装置。

（3）25 ml 或 50 ml 酸式滴定管。

（4）重铬酸钾标准溶液 [C（1/6 K2Cr2O7）=0.025 mol/L]：称取预先在120 ℃烘干2 h的基准或优级纯重铬酸钾1.225 8 g溶于水中，移入1 000 ml容量瓶内，稀释至标线，摇匀。

（5）硫酸亚铁铵标准溶液[C （NH4）2Fe （SO4）2·6H2O≈0.01 mol/L]：称取3.952 g硫酸亚铁铵溶于水中，边搅拌边缓慢加入20 ml浓硫酸，冷却后移入1 000 ml 容量瓶中，稀释至标线，摇匀。临用前，用重铬酸钾标准溶液标定。

标定方法：准确吸取 10.00 ml 重铬酸钾标准溶液于 500 ml 锥形瓶中，加水稀释至 110 ml 左右，缓慢加入 30 ml 浓硫酸，混匀。冷却后，加入3滴试亚铁灵指示剂（约0.15 ml），用硫酸亚铁铵溶液滴定，溶液的颜色由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点（标定应在做样品分析时当天进行）。

按下式计算硫酸亚铁铵溶液浓度：

式中　C——硫酸亚铁铵标准溶液的浓度，mol/L；

V——硫酸亚铁铵标准溶液的用量，ml。

（6）浓硫酸—硫酸银溶液（5 g/500 ml）：于 500 ml 浓硫酸中加入5 g硫酸银，放置1～2 d，不时摇动使其溶解。

（7）10%硫酸—硫酸汞溶液（10 g/100 ml）。

（8）试亚铁灵指示剂：称取1.485 g邻菲啰啉（C12H8N2·H2O）和0.695 g硫酸亚铁（FeSO4·7 H2O）溶于水中稀释至 100 ml，贮于棕色瓶内。

3.分析步骤

（1）取 20.00 m 混合均匀的水样（或适量水样稀释至 20.00 ml）置 250 ml 磨口的回流锥形瓶中，准确加入 10.00 ml重铬酸钾标准溶液及数粒小玻璃球或沸石，连接磨口回流冷凝管，从冷凝管上口慢慢地加入 30 ml 硫酸-硫酸银溶液，轻轻摇动锥形瓶使溶液混匀，加热回流2小时（自开始沸腾时计时）。

注①对于化学需氧量高的废水样，可先取上述操作所需体积1/10的废水样和试剂，于15×150 mm 硬质玻璃试管中，摇匀，加热后观察是否变成绿色。如溶液显绿色，在适量减少废水取样量，直至溶液不变绿色为止，从而确定废水样分析时应取用的体积。稀释时，所取废水样量不得少于5 ml，如果化学需氧量很高，则废水样应多次稀释。

注②废水中氯离子含量超过30 mg/L时，应先把0.4 g硫酸汞加入回流锥形瓶中，再加入20.00 ml废水（或适量废水稀释至 20.00 ml），摇匀。以下操作同上。

（2）冷却后，用90 ml水冲洗冷凝管壁，取下锥形瓶。溶液总体积不得少于 140 ml，否则因酸度太大，滴定终点不明显。

（3）溶液再度冷却后，加3滴试亚铁灵指示液，用硫酸亚铁铵标准溶液滴定，溶液的颜色由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点，记录硫酸亚铁铵标准溶液的用量。

（4）测定水样的同时，以20.00 ml 重蒸馏水，按同样操作步骤作空白试验。记录滴定空白时硫酸亚铁铵标准溶液的用量。

4.数据记录与处理

（1）测量结果记录

①硫酸亚铁铵标准溶液浓度的标定（重铬酸钾标准溶液体积为 10.00 ml）

②化学需氧量的测定

续表

（2）计算=8×1 000（V0-V1）·C/V

式中　C——硫酸亚铁铵标准溶液的浓度（mol/L）；

V0——滴定空白时硫酸亚铁铵标准溶液用量（ml）；

V1——滴定水样时硫酸亚铁铵标准溶液用量（ml）；

V——水样的体积（ml）；

8——氧（1/2O）摩尔质量（g/mol）。

5.注意事项

（1）对于化学需氧量大于50 mg/L 的水样，应改用 0.050 mol/L 重铬酸钾标准溶液。

（2）水样加热回流后，溶液中重铬酸钾剩余量应为加入量的1/5～4/5为宜。

（3）用邻苯二甲酸氢钾标准溶液检查试剂的质量和操作技术时，由于每克邻苯二甲酸氢钾的理论CODCr值为1.176 g，所以溶解0.425 1 g邻苯二甲酸氢钾（HOOCC6H4COOK）于重蒸馏水中，转入 1 000 ml 容量瓶中，稀释至标线，使之成为500 mg/L的CODCr标准溶液。用时新配。

（4）CODCr的测定结果应保留三位有效数字。

（5）每次实验时，应对硫酸亚铁铵滴定液进行标定，室温较高时尤其应注意其浓度的变化。

（6）对于化学需氧量高的废水样，判断是否要稀释，方法是取5 ml原废水样于15 mm×150 mm硬质玻璃试管中，加入5 ml 重铬酸钾标准溶液，再慢慢加入5 ml H2SO4-Ag2SO4溶液，摇匀，观察是否成绿色，如溶液显绿色，要进行水样稀释，直至溶液不变绿色为止。稀释时，所取废水样量不得少于5 ml。

三、思考题

1.K2Cr2O7法测定COD，在回流过程中如溶液颜色变绿，说明什么问题？应如何处理？

2.水中化学需氧量的测定有何意义？

3.氯离子为什么会对实验产生干扰？如何消除其干扰？

技能训练6. 水样生化需氧量的测定——稀释与接种法

一、概述

1.概念及测定意义

生化需氧量又称生化耗氧量，缩写BOD，是表示水中有机物等需氧污染物质含量的一个综合指标，它说明水中有机物出于微生物的生化作用进行氧化分解，使之无机化或气体化时所消耗水中溶解氧的总数量。其值越高，说明水中有机污染物质越多，污染也就越严重。加以悬浮或溶解状态存在于生活污水和制糖、食品、造纸、纤维等工业废水中的碳氢化合物、蛋白质、油脂、木质素等均为有机污染物，可经好氧菌的生物化学作用而分解，由于在分解过程中消耗氧气，故亦称需氧污染物质。若这类污染物质排入水体过多，将造成水中溶解氧缺乏，同时，有机物又通过水中厌氧菌的分解引起腐败现象，产生甲烷、硫化氢、硫醇和氨等恶臭气体，使水体变质发臭。

广泛应用于衡量废水的污染强度和废水处理构筑物的负荷与效率，也用于研究水体的氧平衡。将试样或经过稀释的水样存放培养一段时间，存放前后试样的溶解氧的差就是它的生化需氧量。存放时间的长短和温度都影响耗氧量。现在各国采用培养时间都是5天，温度是20℃，参数称五日生化需氧量，用符号BOD5，20℃表示，温度下标常略去不写，即用符号BOD5表示，也有只用符号BOD表示的。延长存放时间，可以测得微生物降解水中有机物所需的全部氧量，称总生化需氧量，一般则按生化耗氧规律以BOD5推算。生化需氧量的检测不易准确。水样的储放、稀释、接种等检测程序都应按照标准方法进行。对于有毒的工业废水常采用专门的设备处理，有时甚至无法测定。高浓度有机工业废水的BOD5可达数千、数百万毫克/升。城市污水的BOD5在200毫克/升左右。未受废水污染的水体，BOD5常低于2毫克/升。

2.方法选择

测定BOD5的方法有稀释与接种法（HJ 505-2009）、微生物传感器快速测定法（HJ/T 86-2002）、活性污泥曝气降解法等。

稀释与接种法是经典的测定生化需氧量的方法，应用最普遍，适用于地表水、生活污水和工业废水中五日生化需氧量（BOD5）的测定，方法检出限为0.5 mg/L，测定下限为2 mg/L，非稀释法和非稀释接种法的测定上限为6 mg/L，稀释与接种法的测定上限为6 000 mg/L，当水样BOD5大于6 000 mg/L时会因稀释带来一定误差。

微生物传感器快速测定法是一种仪器测定法，适用于BOD5为2～500 mg/L的地表水、生活污水、工业污水的测定，当BOD5较高时可适当稀释后测定。

活性污泥曝气降解法适用于城市污水和组成成分比较稳定的工业污水中BOD5的测定。取50 ml水样，不稀释时可测定8～2 000 mg/L范围的生化需氧量。

本节重点介绍实际测定中常用的稀释与接种法（HJ 505-2009）。

二、稀释与接种法

1.方法原理

生化需氧量是指在规定的条件下，微生物分解水中的某些可氧化的物质，特别是分解有机物的生物化学过程消耗的溶解氧。通常情况下是指水样充满完全密闭的溶解氧瓶中，在（20±1）℃的暗处培养5 d±4 h或（2+5）d±4 h[先在0～4℃的暗处培养2 d，接着在（20±1）℃的暗处培养5 d，即培养（2+5）d]，分别测定培养前后水样中溶解氧的质量浓度，由培养前后溶解氧的质量浓度之差，计算每升样品消耗的溶解氧量，以BOD5形式表示。

若样品中的有机物含量较多，BOD5的质量浓度大于6 mg/L，样品需适当稀释后测定；对不含或含微生物少的工业废水，如酸性废水、碱性废水、高温废水、冷冻保存的废水或经过氯化处理等的废水，在测定BOD5时应进行接种，以引进能分解废水中有机物的微生物。当废水中存在难以被一般生活污水中的微生物以正常的速度降解的有机物或含有剧毒物质时，应将驯化后的微生物引入水样中进行接种。

2.仪器试剂

（1）滤膜：孔径为1.6 μm。

（2）溶解氧瓶：带水封装置，容积250～300 ml。

（3）稀释容器：1 000～2 000 ml的量筒或容量。

（4）虹吸管：供分取水样或添加稀释水。

（5）冰箱：有冷冻和冷藏功能。

（6）带风扇的恒温培养箱：（20±1）℃。

（7）水：实验用水为符合GB/T 6682规定的3级蒸馏水，且水中铜离子的质量浓度不大于0.01 mg/L，不含有氯或氯胺等物质。

（8）接种液：可购买接种微生物用的接种物质，接种液的配制和使用按说明书的要求操作。也可按以下方法获得接种液：

①未受工业废水污染的生活污水：化学需氧量不大于300 mg/L，总有机碳不大于100 mg/L。

②含有城镇污水的河水或湖水。

③污水处理厂的出水。

④分析含有难降解物质的工业废水时，在其排污口下游适当处取水样作为废水的驯化接种液。也可取中和或经适当稀释后的废水进行连续曝气，每天加入少量该种废水，同时加入少量生活污水，使适应该种废水的微生物大量繁殖。当水中出现大量的絮状物时，表明微生物已繁殖，可用作接种液。一般驯化过程需3～8 d。

（9）盐溶液：

①磷酸盐缓冲溶液：将8.5 g磷酸二氢钾（KH2PO4）、21.8 g磷酸氢二钾（K2HPO4）、33.4 g七水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·7H2O）和1.7 g氯化铵（NH4Cl）溶于水中，稀释至1 000 ml，此溶液在0～4℃可稳定保存6个月。此溶液的pH值为7.2；

②硫酸镁溶液，ρ（MgSO4）= 11.0 g/L：将22.5 g七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O）溶于水中，稀释至1 000 ml，此溶液在0～4℃可稳定保存6个月，若发现任何沉淀或微生物生长应弃去；

③氯化钙溶液，ρ（CaCl2）= 27.6 g/L：将27.6 g无水氯化钙（CaCl2）溶于水中，稀释至1 000 ml，此溶液在0～4℃可稳定保存6个月，若发现任何沉淀或微生物生长应弃去；

④氯化铁溶液，ρ（FeCl3）= 0.15 g/L：将0.25 g六水合氯化铁（FeCl3·6H2O）溶于水中，稀释至1 000 ml，此溶液在0～4℃可稳定保存6个月，若发现任何沉淀或微生物生长应弃去。

（10）稀释水：在5～20 L的玻璃瓶中加入一定量的水，控制水温在（20±1）℃，用曝气装置至少曝气1 h，使稀释水中的溶解氧达到8 mg/L以上。使用前每升水中加入上述四种盐溶液各1.0 ml，混匀，20℃保存。在曝气的过程中防止污染，特别是防止带入有机物、金属、氧化物或还原物。

稀释水中氧的质量浓度不能过饱和，使用前需开口放置1 h，且应在24 h内使用。剩余的稀释水应弃去。(www.daowen.com)

（11）接种稀释水：根据接种液的来源不同，每升稀释水中加入适量接种液：城市生活污水和污水处理厂出水加1～10 ml，河水或湖水加10～100 ml，将接种稀释水存放在（20±1）℃的环境中，当天配制当天使用。接种的稀释水pH值为7.2，BOD5应小于1.5 mg/L；

（12）盐酸溶液，c（HCl）=0.5 mol/L：将40 ml浓盐酸（HCl）溶于水中，稀释至1 000 ml；

（13）氢氧化钠溶液，c（NaOH）=0.5 mol/L：将20 g氢氧化钠溶于水中，稀释至1 000 ml；

（14）亚硫酸钠溶液，c（Na2SO3）=0.025 mol/L：将1.575 g亚硫酸钠（Na2SO3）溶于水中，稀释至1 000 ml。此溶液不稳定，需现用现配；

（15）葡萄糖-谷氨酸标准溶液：将葡萄糖（C6H12O6，优级纯）和谷氨酸（HOOC-CH2-CH2-CHNH2-COOH，优级纯）在130℃干燥1 h，各称取150 mg溶于水中，在1 000 ml容量瓶中稀释至标线。此溶液的BOD5为（210±20）mg/L，现用现配。该溶液也可少量冷冻保存，融化后立刻使用；

（16）丙烯基硫脲硝化抑制剂，ρ（C4H8N2S）=1.0 g/L：溶解0.20 g丙烯基硫脲（C4H8N2S）于200 ml水中混合，4℃保存，此溶液可稳定保存14 d；

（17）乙酸溶液，1+1；

（18）碘化钾溶液，ρ（KI）=100 g/L：将10 g碘化钾（KI）溶于水中，稀释至100 ml；

（19）淀粉溶液，ρ=5 g/L：将0.50 g淀粉溶于水中，稀释至100 ml。

3.样品采集和预处理

（1）采集与保存

采集的样品应充满并密封于棕色玻璃瓶中，样品量不小于1 000 ml，在0～4℃的暗处运输和保存，并于24 h内尽快分析。24 h内不能分析，可冷冻保存（冷冻保存时避免样品瓶破裂），冷冻样品分析前需解冻、均质化和接种。

（2）样品的前处理

①pH值调节

若样品或稀释后样品pH值不在6～8范围内，应用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节其pH值至6～8。

②余氯和结合氯的去除

若样品中含有少量余氯，一般在采样后放置1～2 h，游离氯即可消失。对在短时间内不能消失的余氯，可加入适量亚硫酸钠溶液去除样品中存在的余氯和结合氯，加入的亚硫酸钠溶液的量由下述方法确定。

取已中和好的水样100 ml，加入乙酸溶液10 ml、碘化钾溶液1 ml，混匀，暗处静置5 min。用亚硫酸钠溶液滴定析出的碘至淡黄色，加入1 ml淀粉溶液呈蓝色。再继续滴定至蓝色刚刚褪去，即为终点，记录所用亚硫酸钠溶液体积，由亚硫酸钠溶液消耗的体积，计算出水样中应加亚硫酸钠溶液的体积。

③样品均质化

含有大量颗粒物、需要较大稀释倍数的样品或经冷冻保存的样品，测定前均需将样品搅拌均匀。

④样品中有藻类

若样品中有大量藻类存在，BOD5的测定结果会偏高。当分析结果精度要求较高时，测定前应用滤孔为1.6 μm的滤膜过滤，检测报告中注明滤膜滤孔的大小。

⑤含盐量低的样品

若样品含盐量低，非稀释样品的电导率小于125 μS/cm时，需加入适量相同体积的四种盐溶液，使样品的电导率大于125 μS/cm。

4.分析步骤

（1）不经稀释水样的测定

溶解氧含量较高、有机物含量较少的地面水，可不经稀释，而直接以虹吸法，将约20℃的混匀水样转移入两个溶解氧瓶内，转移过程中应注意不使产生气泡。以同样的操作使两个溶解氧瓶充满水样后溢出少许，加塞。瓶内不应有气泡。

其中一瓶随即测定溶解氧，另一瓶的瓶口进行水封后，放入培养箱中，在20±1℃培养5 d。在培养过程中注意添加封口水。

从开始放入培养箱算起，经过五昼夜后，弃去封口水，测定剩余的溶解氧。

（2）需经稀释水样的测定

步骤①稀释倍数的确定

根据实践经验，提出下述计算方法，供稀释时参考。

● 地面水，由测得的高锰酸盐指数与一定系数的乘积，即求得稀释倍数，见下表。

表5-5　高锰酸盐指数与一定系数的乘积求得的稀释倍数

● 工业废水，由重铬酸钾法测得的COD值来确定。通常需做三个稀释比。

使用稀释水时，由COD值分别乘以系数0.075、0.15、0.225，即获得三个稀释倍数。

注：CODcr值可在测定COD过程中，加热回流至60min时，用由校核试验的苯二甲酸氢钾溶液按COD测定相同操作步骤制备的标准色列进行估测。

步骤②稀释操作

● 一般稀释法

按照选定的稀释比例，用虹吸法沿筒壁先引入部分稀释水（或接种稀释水）于1 000 ml量筒中，加入需要量的均匀水样，再引入稀释水（或接种稀释水）至800 ml，用带胶版的玻棒小心上下搅匀。搅拌时勿使搅棒的胶版漏出水面，防止产生气泡。

按不经稀释水样的测定相同操作步骤，进行装瓶、测定当天溶解氧和培养5 d后的溶解氧。

另取两个溶解氧瓶，用虹吸法装满稀释水（或接种稀释水）作为空白试验。测定5 d前后的溶解氧。

● 直接稀释法

在已知两个容积相同（其差＜ 1 ml）的溶解氧瓶内，用虹吸法加入部分稀释水（或接种稀释水），再加入根据瓶容积和稀释比例计算出的水样量，然后用稀释水（或接种稀释水）使刚好充满，加塞，勿留气泡于瓶内。其余操作与上述一般稀释法相同。

BOD5测定中，一般采用叠氮化钠改良法测定溶解氧。如遇干扰物质，应根据具体情况采用其他方法（详见溶解氧测定方法）。

5.数据记录与处理

（1）测量结果记录

项目名称________________样品性质______________分析方法____________________

仪器名称及编号__________培养时间______年______月______日______时 室温______℃

至 年______月 日 时 室温 ℃

（2）计算

①不经稀释直接培养的水样：

式中　C1——水样在培养前的溶解氧浓度（mg/L）；

C2——水样经5 d培养后，剩余溶解氧浓度（mg/L）。

②经稀释后培养的水样：

式中　B1——稀释水（或接种稀释水）在培养前的溶解氧（mg/L）；

B2——稀释水（或接种稀释水）在培养后的溶解氧（mg/L）；

f1——稀释水（或接种稀释水）在培养液中所占比例；

f2——水样在培养液中所占比例。

6.注意事项

（1）水中有机物的生物氧化过程，可分为两个阶段。第一阶段为有机物中的碳和氢，氧化生成二氧化碳和水，此阶段称为碳化阶段。完成碳化阶段在20 ℃大约需要20 d。第二阶段为含氮物质及部分氨，氧化为亚硝酸盐及硝酸盐，称为硝化阶段。完成硝化阶段在20 ℃时需要约100天。因此，一般测定水样BOD5时，硝化作用很不显著或根本不发生硝化作用。但对于生物处理池的出水，因其中含有大量的硝化细菌。因此，在测定BOD5时也包括了部分含氮化合物的需氧量。对于这样的水样，如果我们只需要测定有机物降解的需氧量，可以加入硝化抑制剂，抑制硝化过程。为此目的，可在每升稀释水样中加入1 ml浓度为500 mg/L的丙烯基硫脲（ATU，C4H8N2S）或一定量固定在氯化钠上的2-氯代-6-三氯甲基吡啶（TCMP，Cl-C5H3N-C-CH3），使TCMP在稀释样品中的浓度约为0.5 mg/L。

（2）玻璃器皿应彻底洗净。先用洗涤剂浸泡清洗，然后用稀盐酸浸泡，最后依次用自来水、蒸馏水洗净。

（3）在两个或三个稀释比的样品中，凡消耗溶解氧大于2 mg/L和剩余溶解氧大于1 mg/L时，计算结果时，应取其平均值。若剩余溶解氧小于1 mg/L，甚至为零时，应加大稀释比。溶解氧消耗量小于2 mg/L，有两种可能，一是稀释倍数过大；另一种可能是微生物菌种不适应，活性差，或含毒物质浓度过大。这时可能出现在几个稀释比中，稀释倍数大的消耗溶解氧反而较多的现象。

（4）为检查稀释水和接种液的质量，以及化验人员的操作水平，可将20 ml葡萄糖—谷氨酸标准溶液用接种稀释水稀释至1 000 ml，按测定BOD5的步骤操作。测得的BOD5的值应在180～230 mg/L之间。否则应检查接种液、稀释水的质量或操作技术是否存在问题。

（5）水样稀释倍数超过100倍时，应预先在容量瓶中用水初步稀释后，再取适量进行最后稀释培养。

三、思考题

1.稀释与接种法对某一水样进行BOD5测定时，水样经5天培养后，测其溶解氧，当向水样中加入1 ml硫酸锰和2 ml碱性碘化钾溶液时，出现白色絮状沉淀。这说什么？

2.某分析人员用稀释与接种法测定某水样的BOD5，将水样稀释10倍后测得第一天溶解氧为7.98 mg/L，第五天的溶解氧为0.65 mg/L，问此水样中的BOD5值是多少？为什么？应如何处理？

3.如何制备稀释水？

技能训练7. 水中石油类的测定

一、概述

1.污染来源与危害

环境水体中石油类污染物来自工业污水和生活污水。工业污水中石油类（各种烃的混合物）污染物主要来自原油的开采、加工、运输以及各种烃油企业等行业。

石油类化合物漂浮于水体表面，直接影响空气与水体界面之间的氧交换；分散于水体中的油常被微生物氧化分解而消耗水中的溶解氧，使水质恶化。在《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB 18918-2002）规定中，石油类属于基本控制项目。

2.测定方法选择

石油类的测定方法有重量法、红外分光光度法和非色散红外法等。重量法是常用的分析方法，不受油品种限制，但操作繁杂，灵敏度低，只适用于测定10 mg/L以上的含油水样，方法的精密度随操作条件和熟练程度的不同有很大差别。非分散红外法同样适用于上述水样中石油类和动、植物油的测定。水样体积为0.5～5 L时，测定范围为0.02～1 000 mg/L。当水样中含有大量芳烃及其衍生物时，需和红外分光光度法进行对比试验。

二、重量法

1.原理

以硫酸酸化水样，用石油醚萃取矿物油，蒸除石油醚后，称其重量。此法测定的是酸化样品中可被石油醚萃取的、且在试验过程中不挥发的物质总量。溶剂去除时，使得轻质油有明显损失。由于石油醚对油有选择地溶解，因此，石油的较重成分中可能含有不为溶剂萃取的物质。

2.仪器

（1）分析天平。

（2）恒温箱。

（3）恒温水浴锅。

（4）1 000 ml分液漏斗。

（5）干燥器。

（6）直径11 cm中速定性滤纸。

3.试剂

（1）石油醚：将石油醚（沸程30～60℃）重蒸馏后使用。100 ml石油醚的蒸干残渣不应大于0.2 mg。

（2）无水硫酸钠：在300 ℃马福炉中烘1 h，冷却后装瓶备用。

（3）1+1硫酸。

（4）氯化钠。

4.测定步骤

（1）在采集瓶上作一容量记号后（以便以后测量水样体积），将所收集的大约1 L已经酸化（pH值＜2）水样，全部转移至分液漏斗中，加入氯化钠，其量约为水样量的8%。用25 ml石油醚洗涤采样瓶并转入分液漏斗中，充分摇匀3 min，静置分层并将水层放入原采样瓶内，石油醚层转入100 ml锥形瓶中。用石油醚重复萃取水样两次，每次用量25 ml，合并三次萃取液于锥形瓶中。

（2）向石油醚萃取液中加入适量无水硫酸钠（加入至不再结块为止），加盖后，放置0.5 h以上，以便脱水。

（3）用预先以石油醚洗涤过的定性滤纸过滤，收集滤液于100 ml已烘干至恒重的烧杯中，用少量石油醚洗涤锥形瓶、硫酸钠和滤纸，洗涤液并入烧杯中。

（4）将烧杯置于65±5 ℃水浴上，蒸出石油醚。近于后再置于65±5 ℃恒温箱内烘干1 h，然后放入干燥器中冷却30 min，称量。

5.计算

式中　W1——烧杯加油总重量（g）；

W2——烧杯重量（g）；

V——水样体积（ml）。

6.注意事项

（1）分液漏斗的活塞不要涂凡士林。

（2）测定废水中石油类时，若含有大量动、植物性油脂，应取内径20 mm，长300 mm一端呈漏斗状的硬质玻璃管，填装100 mm厚活性层析氧化铝（在150～160℃活化4 h，未完全冷却前装好柱），然后用10 ml石油醚清洗。将石油醚萃取液通过层析柱，除去动、植物性油脂，收集流出液于恒重的烧杯中。

（3）采样瓶应为清洁玻璃瓶，用洗涤剂清洗干净（不要用肥皂）。应定容采样，并将水样全部移入分液漏斗测定，以减少油附着于容器壁上引起的误差。

三、紫外分光光度法

1.原理

石油及其产品在紫外光区有特征吸收，带有苯环的芳香族化合物，主要吸收波长为250～260 nm；带有共轭双键的化合物主要吸收波长为215～230 nm。一般原油的两个主要吸收波长为225及254 nm。石油产品中，如燃料油、润滑油等的吸收峰与原油相近。因此，波长的选择应视实际情况而定，原油和重质油可选254 nm，而轻质油及炼油厂的油品可选225 nm。

标准油采用受污染地点水样中的石油醚萃取物。如有困难可采用15号机油、20号重柴油或环保部门批准的标准油。

水样加入1～5倍含油量的苯酚，对测定结果无干扰，动、植物性油脂的干扰作用比红外线法小。用塑桶采集或保存水样，会引起测定结果偏低。

2.仪器

（1）分光光度计（具215～256 nm波长），10 nm石英比色皿。

（2）1 000 ml分液漏斗。

（3）50 ml容量瓶。

（4）G3型25 ml玻璃砂芯漏斗。

3.试剂

（1）标准油：用经脱芳烃并重蒸馏过的30～60℃石油醚，从待测水样中萃取油品，经无水硫酸钠脱水后过滤。将滤液置于65±5℃水浴上蒸出石油醚，然后置于65±5℃恒温箱内赶尽残留的石油醚，即得标准油品。

（2）标准油贮备溶液：准确称取标准油品0.100 g溶于石油醚中，移入100 ml容量瓶内，稀释至标线，贮于冰箱中。此溶液每毫升含1.00 mg油。

（3）标准油使用溶液：临用前把上述标准油贮备液用石油醚稀释10倍，此液每毫升含0.10 mg油。

（4）无水硫酸钠：在300℃下烘1 h，冷却后装瓶备用。

（5）石油醚（60～90℃馏分）。脱芳烃石油醚：将60～100目粗孔微球硅胶和70～120目中性层析氧化铝（在150～160℃活化4 h），在未完全冷却前装入内径25 mm（其他规格也可）高750 mm的玻璃柱中。下层硅胶高600 mm，上面覆盖50 mm厚的氧化铝，将60～90℃石油醚通过此柱以脱除芳烃。收集石油醚于细口瓶中，以水为参比，在225 nm处测定处理过的石油醚，其透光率不应小于80%。

（6）1+1硫酸。

（7）氯化钠。

4.测定步骤

（1）向7个50 ml容量瓶中，分别加入0、2.00 ml、4.00 ml、8.00 ml、12.00 ml、20.00 ml和25.00 ml标准油使用溶液，用石油醚（60～90℃）稀释至标线。在选定波长处，用10 mm石英比色皿，以石油醚为参比测定吸光度，经空白校正后，绘制标准曲线。

（2）将已测量体积的水样，仔细移入1 000 ml分液漏斗中，加入1+1硫酸5 ml酸化（若采样时已酸化，则不需加酸）。加入氯化钠，其量约为水量的2%（m/V）。用20 ml石油醚（60～90℃馏分）清洗采样瓶后，移入分液漏斗中。充分振摇3 min，静置使之分层，将水层移入采样瓶内。

（3）将石油醚萃取液通过内铺约5 mm厚度无水硫酸钠层的砂芯漏斗，滤入50 ml容量瓶内。

（4）将水层移回分液漏斗内，用20 ml石油醚重复萃取一次，同上操作。然后用10 ml石油醚洗涤漏斗，其洗涤液均收集于同一容量瓶内，并用石油醚稀释至标线。

（5）在选定的波长处，用10 mm石英比色皿，以石油醚为参比，测量其吸光度。

（6）取水样相同体积的纯水，与水样同样操作，进行空白试验，测量吸光度。

（7）由水样测得的吸光度，减去空白试验的吸光度后，从标准曲线上查出相应的油含量。

5.计算

式中　m——从标准曲线中查出相应油的量（mg）；

V——水样体积（ml）。

6.注意事项

（1）不同油品的特征吸收峰不同，如难以确定测定的波长时，可向50 ml容量瓶中移入标准油使用溶液20～25 ml，用石油醚稀释至标线，在波长为215～300 nm间，用10 mm石英比色皿测得吸收光谱图（以吸光度为纵坐标，波长为横坐标的吸光度曲线），得到最大吸收峰的位置。一般在220～225 nm。

（2）使用的器皿应避免有机物污染。

（3）水样及空白测定所使用的石油醚应为同一批号，否则会由于空白值不同而产生误差。

（4）如石油醚纯度较低，或缺乏脱芳烃条件，亦可采用己烷作萃取剂。把己烷进行重蒸馏后使用，或用水洗涤3次，以除去水溶性杂质。以水作参比，于波长225 nm处测定，其透光率应大于80%方可使用。

四、思考题

1.怎样检验校正系数？

2.每批样品分析前，是否需要做方法空白实验？

技能训练8. 水中阴离子表面活性剂的测定——亚甲蓝分光光度法

一、概述

1.污染来源及危害

表面活性剂是一类极为重要的精细化工产品，广泛应用于日化、纺织、医药、采矿、采油和建筑等行业，也是日常生活中不可缺少的消费品。随着人们生活水平的提高，各种表面活性剂的消耗量不断增加，尤其是阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂是普通合成洗涤剂的主要活性成分，使用最广泛的阴离子表面活性剂是直链烷基苯磺酸钠（LAS）。由于它的大量使用，导致了很多未经妥善处理的阴离子表面活性剂排放到河流、海洋等环境水体中。

当水体中的阴离子表面活性剂达到一定浓度时，它们就会在水体表面形成泡沫覆盖层，阻碍大气中的氧进入水体，从而造成水域局部缺氧，导致水质恶化，并且会对水生生物过氧化酶的活性产生急剧影响，破坏细胞生理功能，甚至会导致大量水生生物死亡。

2.测定方法

在《城镇污水处理厂污染物排放标准》GB 18918-2002规定中，阴离子表面活性剂被列为基本控制项目。水中阴离子表面活性剂的测定方法，主要有液相色谱法、电位滴定法、流动注射法和亚甲蓝分光光度法等。以下着重介绍亚甲蓝分光光度法（GB 7494-87），该法适用于测定饮用水、地面水生活污水及工业废水中的低浓度亚甲蓝活性物质（MBAS），亦即阴离子表面活性剂。在实验条件下，主要被测物质是LAS、烷基磺酸钠和脂肪醇硫酸钠，但可能存在一些正的和负的干扰。该方法采用LAS作为标准物，其烷基碳链在C10～C13之间，平均碳数为12，平均分子量为344.4。当采用10 mm光程的比色皿，试样体积为100 ml时，本方法最低检出浓度为0.05 mg/L的LAS，检出上限为2.0 mg/L的LAS。

二、亚甲蓝分光光度法

1.原理

阴离子染料亚甲蓝与阴离子表面活性剂作用，生成蓝色的盐类，统称亚甲蓝活性物质（MBAS）。该生成物可被氯仿萃取，其色度与浓度成正比，用分光光度计在波长652 nm处测量氯仿层的吸光度。

2.试剂

（1）氢氧化钠（NaOH）：1 mol/L。

（2）硫酸（H2SO4）：0.5 mol/L。

（3）氯仿（CHCl3）。

（4）直链烷基苯磺酸钠贮备溶液：秤取0.100 g标准物质LAS（平均分子量344.4），准确至0.001 g，溶于50 ml水中，转移到100 ml容量瓶中，稀释至标线并混匀。每毫升含1.00 mgLAS。保存于4℃冰箱中。如需要，每周配置一次。

（5）直链烷基苯磺酸钠标准溶液：准确吸取10.00 ml直链烷基苯磺酸钠贮备溶液，用水稀释至1 000 ml，每毫升含10.0 μgLAS。当天配置。

（6）亚甲蓝溶液：先秤取50 g一水磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）溶于300 ml水中，转移到1 000 ml容量瓶内，缓慢加入6.8 ml浓硫酸（H2SO4，ρ=1.84 g/ml），摇匀。另秤取30 mg亚甲蓝（指示剂级），用50 ml水溶解后也移入容量瓶，用水稀释至标线，摇匀。此溶液贮存于棕色试剂瓶中。

（7）洗涤液：秤取50 g一水磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）溶于300 ml水中，转移到1 000 ml容量瓶内，缓慢加入6.8 ml浓硫酸（H2SO4，ρ=1.84 g/ml），用水稀释至标线。

（8）酚酞指示剂溶液：将1.0 g酚酞溶于50 ml乙醇[C2H5OH，95%（V/V）]中，然后边搅拌边加入50 ml水，滤去形成的沉淀。

（9）玻璃棉或脱脂棉：在索氏抽提器中用氯仿提取4 h后，取出干燥，保存在清洁的玻璃瓶中待用。

3.仪器

（1）分光光度计：能在652 nm进行测量，配有5、10、20 mm比色皿。

（2）分液漏斗：250 ml，最好用聚四氟乙烯（PTFE）活塞。

（3）索氏抽提器：150 ml平底烧瓶，Φ35×160 mm抽出筒，蛇形冷凝管。

注：玻璃器皿在使用前先用水彻底清洗，然后用10%（m/m）的乙醇盐酸清洗，最后用水冲洗干净。

4.样品

取样和保存样品应使用清洁的玻璃瓶，并事先经甲醇清洗过。短期保存建议冷藏在4℃冰箱中，如果样品需保存超过24 h，则应采取保护措施。保存期为4天，加入1%（V/V）的40%（V/V）甲醛溶液即可，保存期长达8天，则需用氯仿饱和水样。

本方法目的是测定水样中的溶解态的阴离子表面活性剂。在测定前，应将水样预先经中速定性滤纸过滤以去除悬浮物。吸附在悬浮物上的表面活性剂不计在内。

5.步骤

（1）校准

取一组分液漏斗10个，分别加入100 ml、99 ml、97 ml、95 ml、93 ml、91 ml、89 ml、87 ml、85 ml、80 ml水，然后分别移入0、1.00 ml、3.00 ml、5.00 ml、7.00 ml、9.00 ml、11.00 ml、13.00 ml、15.00 ml、20.00 ml直链烷基苯磺酸钠标准溶液，摇匀。按6.3处理每一标准，以测得的吸光度扣除试剂空白值（零标准溶液的吸光度）后与相应的LAS量（μg）绘制校准曲线。

（2）试份体积

为了直接分析水和废水样，应根据预计的亚甲蓝表面活性物质的浓度选用试份体积，见下表：

当预计的MBAS浓度超过2 mg/L时，按上表选取试份量，用水稀释至100 ml。

（3）测定

①将所取试份移至分液漏斗，以酚酞为指示剂，逐滴加入1 mol/L氢氧化钠溶液至水溶液呈桃红色，再滴加0.5 mol/L硫酸到桃红色刚好消失。

②加入25 ml亚甲蓝溶液，摇匀后再移入10 ml氯仿，激烈振摇30 s，注意放气。过分的摇动会发生乳化，加入少量异丙醇（小于10 ml）可消除乳化现象。加相同体积的异丙醇至所有的标准中，在慢慢旋转分液漏斗，使滞留在内壁上的氯仿液珠降落，静置分层。

③将氯仿层放入预先盛有50 ml洗涤液的第二个分液漏斗，用数滴氯仿淋洗第一个分液漏斗的放液管，重复萃取三次，每次用10 ml氯仿。合并所有氯仿至第二个分液漏斗中，激烈摇动30 s，静置分层。将氯仿层通过玻璃棉或脱脂棉，放入50 ml容量瓶中。再用氯仿萃取洗涤液两次（每次用量5 ml），此氯仿层也并入容量瓶中，加氯仿至标线。

注：a.如水相中蓝色变淡或消失，说明水样中亚甲蓝表面活性物（MBAS） 浓度超过了预计值，以致加入的亚甲蓝全部被反应掉。应弃去试样，再取一份较少量的试份重新分析。

b.测定含量低的饮用水及地面水可将萃取用的氯仿总量降至25 ml。三次萃取用量分别为10 ml、5 ml、5 ml，再用3～4 ml氯仿萃取洗涤液，此时检测下限可达到0.02 mg/L。

④每一批样品要做一次空白试验及一种校准溶液的完全萃取。

⑤每次测定前，振荡容量瓶中的氯仿萃取液，并以此液洗三次比色皿，然后将比色皿充满。

⑥在652 nm处，以氯仿为参比液，测定样品、校准溶液和空白试验的吸光度。应使用相同光程的比色皿。每次测定后，用氯仿清洗比色皿。

⑦以试份的吸光度减去空白试验的吸光度后，从校准曲线上查得LAS的质量。

（4）空白试验

按规定进行空白试验，仅用100 ml水代替试样。在实验条件下，每10 mm光程长空白试验的吸光度不应超过0.02，否则应仔细检查设备和试剂是否有污染。

6.结果表示

用亚甲蓝活性物质（MBAS）报告结果，以LAS计，平均分子量为344.4。

（1）计算方法

式中　C——水样中亚甲蓝活性物（MBAS）的浓度，mg/L

m——从校准曲线上读取的表观LAS质量，μg

V——试份的体积，ml

结果以三位小数表示。

（2）精密度和准确度

8个实验室分析含LAS 0.305 mg/L的统一分发标准溶液的结果如下：

● 重复性——实验室内相对标准偏差为2.3%。

● 再现性——实验室间相对标准偏差为4.3%。

● 准确度——相对误差为-2.0%。

7.干扰及其消除

（1）主要被测物以外的其他有机的硫酸盐、磺酸盐、羧酸盐、酚类以及无机的硫氰酸盐、氰酸盐、硝酸盐和氯化物等，他们或多或少的与亚甲蓝作用，生成可溶于氯仿的蓝色络合物，致使测定结果偏高。通过水溶液反洗可消除这些正干扰（有机硫酸盐、磺酸盐除外），其中氯化物和硝酸盐的干扰大部分被去除。

（2）经水溶液反洗仍未除去的非表面活性物引起的正干扰，可借气提萃取法将阴离子表面活性剂从水相转移到有机相而加以消除。

（3）一般存在于未经处理或一级处理的污水中的硫化物，它能与亚甲蓝反映，生成无色的还原物而消耗亚甲蓝试剂。可将试样调制碱性，滴加适量的过氧化氢（H2O2，30%），避免其干扰。

（4）存在季铵类化合物等阳离子物质和蛋白质时，阴离子表面活性剂将与其作用，生成稳定的络合物，而不与亚甲蓝反映，使测定结果偏低。这些阳离子类干扰物可采用阳离子交换树脂（在适当条件下）去除。

生活污水及工业废水中的一般成分，包括尿素、氨、硝酸盐，以及防腐用的甲醛和氯化汞以表明不产生干扰。然而，并非所有天然的干扰物都能消除，因此被检物总体应确切的称为阴离子表面活性物质或亚甲蓝活性物质（MBAS）。

8.试验报告

试验报告应包括下述内容：

（1）对样品性质的描述。

（2）所用方法的参考文献。

（3）结果及其表示方法。

（4）试验过程中观察到的异常现象。

（5）本方法中未曾规定的操作，或可能影响结果的操作等。

三、思考题

1.水中阴离子表面活性剂的检测方法有哪些？

2.亚甲蓝分光光度法测定阴离子表面活性剂影响因素有哪些？

技能训练9. 水中总有机碳的测定

一、概述

1.定义

总有机碳（TOC）是以碳的含量表示水体中有机物质总量的综合指标。由于TOC的测定采用燃烧法，因此能将有机物全部氧化，它比BOD5或COD更能反映有机物的总量。

总碳（TC）指水中存在的有机碳、无机碳和元素碳的总含量。

无机碳（IC）指水中存在的元素碳、二氧化碳、一氧化碳、碳化物、氰酸盐、氰化物和硫氰酸盐的含碳量。

可吹扫有机碳（POC）指在本标准规定条件下水中可被吹扫出的有机碳。

不可吹扫有机碳（NPOC）指在本标准规定条件下水中不可被吹扫出的有机碳。

2.测定方法

目前广泛应用的测定TOC的方法是燃烧氧化-非色散红外吸收法。其测定原理是：将一定量水样注入高温炉内的石英管，在900～950℃温度下，以铂和三氧化钴或三氧化二铬为催化剂，使有机物燃烧裂解转化为二氧化碳，然后用红外线气体分析仪测定CO2含量，从而确定水样中碳的含量。因为在高温下，水样中的碳酸盐也分解产生二氧化碳，故上面测得的为水样中的总碳（TC）。为获得有机碳含量，可采用两种方法：一是将水样预先酸化，通入氮气曝气，驱除各种碳酸盐分解生成的二氧化碳后再注入仪器测定。另一种方法是使用高温炉和低温炉皆有的TOC测定仪。将同一等量水样分别注入高温炉（900℃）和低温炉（150℃），则水样中的有机碳和无机碳均转化为CO2，而低温炉的石英管中装有磷酸浸渍的玻璃棉，能使无机碳酸盐在150℃分解为CO2，有机物却不能被分解氧化。将高、低温炉中生成的CO2依次导入非色散红外气体分析仪，分别测得总碳（TC）和无机碳（IC），二者之差即为总有机碳（TOC）。该方法最低检出浓度为0.5 mg/L。

二、燃烧氧化-非分散红外吸收法

1.方法原理

（1）差减法测定总有机碳

将试样连同净化气体分别导入高温燃烧管和低温反应管中，经高温燃烧管的试样被高温催化氧化，其中的有机碳和无机碳均转化为二氧化碳，经低温反应管的试样被酸化后，其中的无机碳分解成二氧化碳，两种反应管中生成的二氧化碳分别被导入非分散红外检测器。在特定波长下，一定质量浓度范围内二氧化碳的红外线吸收强度与其质量浓度成正比，由此可对试样总碳（TC）和无机碳（IC）进行定量测定。总碳与无机碳的差值，即为总有机碳。

（2）直接法测定总有机碳

试样经酸化曝气，其中的无机碳转化为二氧化碳被去除，再将试样注入高温燃烧管中，可直接测定总有机碳。由于酸化曝气会损失可吹扫有机碳（POC），故测得总有机碳值为不可吹扫有机碳（NPOC）。

2.干扰及消除

水中常见共存离子超过下列质量浓度时：、Cl- 400 mg/L、NO3- 100 mg/L、、S2- 100 mg/L，可用无二氧化碳水稀释水样，至上述共存离子质量浓度低于其干扰允许质量浓度后，再进行分析。

3.试剂和材料

（1）无二氧化碳水：将重蒸馏水在烧杯中煮沸蒸发（蒸发量10%），冷却后备用。也可使用纯水机制备的纯水或超纯水。无二氧化碳水应临用现制，并经检验TOC质量浓度不超过0.5 mg/L。

（2）硫酸（H2SO4）：ρ（H2SO4）=1.84 g/ml。

（3）邻苯二甲酸氢钾（KHC8H4O4）：优级纯。

（4）无水碳酸钠（Na2CO3）：优级纯。

（5）碳酸氢钠（NaHCO3）：优级纯。

（6）氢氧化钠溶液：ρ（NaOH）=10 g/L。

（7）有机碳标准贮备液：ρ（有机碳，C）= 400 mg/L。准确称取邻苯二甲酸氢钾（预先在110～120℃下干燥至恒重）0.850 2 g，置于烧杯中，加无二氧化碳水溶解后，转移此溶液于1 000 ml容量瓶中，用无二氧化碳水稀释至标线，混匀。在4℃条件下可保存两个月。

（8）无机碳标准贮备液：ρ（无机碳，C）=400 mg/L。准确称取无水碳酸钠（预先在105 ℃下干燥至恒重）1.763 4 g和碳酸氢钠（预先在干燥器内干燥）1.400 0 g，置于烧杯中，加无二氧化碳水溶解后，转移此溶液于1 000 ml容量瓶中，用无二氧化碳水稀释至标线，混匀。在4 ℃条件下可保存两周。

（9）差减法标准使用液：ρ（总碳，C）= 200 mg/L，ρ（无机碳，C）= 100 mg/L。用单标线吸量管分别吸取50.00 ml有机碳标准贮备液和无机碳标准贮备液于200 ml容量瓶中，用无二氧化碳水稀释至标线，混匀。在4℃条件下贮存可稳定保存一周。

（10）直接法标准使用液：ρ（有机碳，C）= 100 mg/L，用单标线吸量管吸取50.00 ml有机碳标准贮备液于200 ml容量瓶中，用无二氧化碳水稀释至标线，混匀。在4℃条件下贮存可稳定保存一周。

（11）载气：氮气或氧气，纯度大于99.99%。

4.仪器和设备

（1）非分散红外吸收TOC分析仪。

（2）一般实验室常用仪器。

5.样品

水样应采集在棕色玻璃瓶中并应充满采样瓶，不留顶空。水样采集后应在24 h内测定。否则应加入硫酸将水样酸化至pH值≤2，在4℃条件下可保存7 d。

6.分析步骤

（1）仪器的调试：按TOC分析仪说明书设定条件参数，进行调试。

（2）校准曲线的绘制

①差减法校准曲线的绘制：在一组七个100 ml容量瓶中，分别加入0.00、2.00 ml、5.00 ml、10.00 ml、20.00 ml、40.00 ml、100.00 ml差减法标准使用液，用无二氧化碳水稀释至标线，混匀。配制成总碳质量浓度为0.0、4.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、40.0 mg/L、80.0 mg/L、200.0 mg/L和无机碳质量浓度为0.0、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、40.0 mg/L、100.0 mg/L的标准系列溶液，按照样品测定的步骤测定其响应值。以标准系列溶液质量浓度对应仪器响应值，分别绘制总碳和无机碳校准曲线。

②直接法校准曲线的绘制

在一组七个100 ml容量瓶中，分别加入0.00、2.00 ml、5.00 ml、10.00 ml、20.00 ml、40.00 ml、100.00 ml直接法标准使用液（5.10），用无二氧化碳水稀释至标线，混匀。配制成有机碳质量浓度为0.0、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、40.0 mg/L、100.0 mg/L的标准系列溶液，按照样品测定的步骤测定其响应值。以标准系列溶液质量浓度对应仪器响应值，绘制有机碳校准曲线。

（3）空白试验

用无二氧化碳水代替试样，按照样品测定的步骤测定其响应值。每次试验应先检测无二氧化碳水的TOC含量，测定值应不超过0.5 mg/L。

（4）样品测定

①差减法：经酸化的试样，在测定前应以氢氧化钠溶液中和至中性，取一定体积注入TOC分析仪进行测定，记录相应的响应值。

②直接法：取一定体积酸化至pH值≤2的试样注入TOC分析仪，经曝气除去无机碳后导入高温氧化炉，记录相应的响应值。

7.结果计算

（1）差减法

根据所测试样响应值，由校准曲线计算出总碳和无机碳质量浓度。试样中总有机碳质量浓度为：

式中　ρ（TOC）——试样总有机碳质量浓度，mg/L；

ρ（TC）——试样总碳质量浓度，mg/L；

ρ（IC）——试样无机碳质量浓度，mg/L。

（2）直接法

根据所测试样响应值，由校准曲线计算出总有机碳的质量浓度ρ（TOC）。

（3）结果表示

当测定结果小于100 mg/L时，保留到小数点后一位；大于等于100 mg/L时，保留三位有效数字。

8.精密度和准确度

六个实验室测定TOC质量浓度为24.0 mg/L的统一分发标准溶液，实验室内相对标准偏差为2.9%，实验室间相对标准偏差为3.9%，相对误差为2.9%～6.3%。

六个实验室对地表水、生活污水和工业废水进行加标回收试验，差减法的回收率为91.0%～109%，直接法的回收率为93.0%～109%。

9.质量保证和质量控制

（1）每次试验前应检测无二氧化碳水的TOC含量，测定值应不超过0.5 mg/L。

（2）每次试验应带一个曲线中间点进行校核，校核点测定值和校准曲线相应点浓度的相对误差应不超过10%。

三、思考题

1.若用直接法测定水样的总有机碳，该如何进行前处理？

2.差减法测定水样TOC时，为什么要先测TIC后测TC呢？

3.燃烧氧化-非分散红外吸收法测定总有机碳（差减法测定）的方法原理是什么？

4.在水样常见共存离子含量超过允许值时，应该怎样进行处理？

技能训练10. 水中总大肠菌群的测定——多管发酵法

一、概述

1.总大肠菌群及其来源

所谓大肠菌群，是指在37 ℃条件下24 h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。水的大肠菌群数是指100 ml水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数（MPN）表示。在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽孢杆菌等多种细菌。这些细菌都可随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量最多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标，因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。

2.测定方法

在《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB 18918-2002）中规定，总大肠菌群数（个/L）属于基本控制项目。测定可以用多管发酵法、滤膜法（HJ/T 347-2007）和纸片快速法（HJ 755-2015）。多管发酵法和滤膜法（HJ/T 347-2007）适用于地表水、地下水及废水中总大肠菌群的测定；纸片快速法（HJ 755-2015）适用于地表水、废水中总大肠菌群和粪大肠菌群的快速测定。以下着重介绍多管发酵法。

二、多管发酵法

1.原理

总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法的原理是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN表示。

2.仪器

（1）高压蒸气灭菌器。

（2）恒温培养箱、冰箱。

（3）生物显微镜、载玻片。

（4）酒精灯、镍铬丝接种棒。

（5）培养皿（直径100 mm）、试管（5×150 mm），吸管（1 ml、5 ml、10 ml）、烧杯（200 ml、500 ml、2 000 ml）、锥形瓶（500 ml、1 000 ml）、采样瓶。

3.培养基及染色剂的制备

（1）乳糖蛋白胨培养液：将10 g蛋白胨、3 g牛肉膏、5 g乳糖和5 g氯化钠加热溶解于1 000 ml蒸馏水中，调节溶液pH值为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1 ml，充分混匀，分装于试管中，于121 ℃高压灭菌器中灭菌15 min，贮存于冷暗处备用。

（2）三倍浓缩乳糖蛋白陈培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸馏水外，各组分用量增加至三倍。

（3）品红亚硫酸钠培养基

①贮备培养基的制备：于2 000 ml烧杯中，先将20～30 g琼脂加到900 ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入3.5 g磷酸氢二钾及10 g蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水补充到1 000 ml，调节溶液pH值至7.2～7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加10 g乳糖，混匀，定量分装于250 ml或500 ml锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在121 ℃灭菌15 min，贮存于冷暗处备用。

②平皿培养基的制备：将上法制备的贮备培养基加热融化。根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌试管中；再按比例称取无水亚硫酸钠，置于另一灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10 min（灭菌）。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色再退至淡红色为止（不宜加多）。将此混合液全部加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。立即将此培养基适量（约15 ml）倾入已灭菌的平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用，但保存时间不宜超过两周。如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。

（4）伊红美蓝培养基

①贮备培养基的制备：于2 000 ml烧杯中，先将20～30 g琼脂加到900 ml蒸馏水中，加热溶解。再加入2 g磷酸二氢钾及10 g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至1 000 ml，调节溶液pH值至7.2～7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀后定量分装于250或500 ml锥形瓶内，于121 ℃高压灭菌15 min，贮于冷暗处备用。

②平皿培养基的制备：将上述制备的贮备培养基融化。根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液（0.4 g伊红溶于20 ml水中）和一定量已灭菌的0.5%美蓝水溶液（0.065 g美蓝溶于13 ml水中），加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此培养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用。

（5）革兰氏染色剂

①结晶紫染色液：将20 ml结晶紫乙醇饱和溶液（称取4～8 g结晶紫溶于100 ml 95%乙醇中）和80 ml 1%草酸铵溶液混合、过滤。该溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。

②助染剂：将1 g碘与2 g碘化钾混合后，加入少许蒸馏水，充分振荡，待完全溶解后，用蒸馏水补充至300 ml。此溶液两周内有效。当溶液由棕黄色变为淡黄色时应弃去。为易于贮备，可将上述碘与碘化钾溶于30 ml蒸馏水中，临用前再加水稀释。

③脱色剂：95%乙醇。

④复染剂：将0.25 g沙黄加到10 ml 95%乙醇中，待完全溶解后，加90 ml蒸馏水。

4.测定步骤

● 生活饮用水

（1）初发酵试验：在两个装有已灭菌的50 ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中（内有倒管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样100 ml。在10支装有已灭菌的5 ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样10 ml，混匀后置于37 ℃恒温箱内培养24 h。

（2）平板分离：上述各发酵管经培养24 h后，将产酸、产气及只产酸的发酵管分别接种于伊红美蓝培养基或品红亚硫酸钠培养基上，置于37 ℃恒温箱内培养24 h，挑选符合下列特征的菌落。

①伊红美蓝培养基上：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。

②品红亚硫酸钠培养基上：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落。

（3）取有上述特征的群落进行革兰氏染色

①用已培养18～24 h的培养物涂片，涂层要薄。

②将涂片在火焰上加温固定，待冷却后滴加结晶紫溶液，1 min后用水洗去。

③滴加助染剂，1 min后用水洗去。

④滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止（20～30 s），用水洗去。

⑤滴加复染剂，1 min后用水洗去，晾干、镜检，呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者为阴性菌。

（4）复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管（瓶）的最典型菌落1～3个，然后置于37 ℃恒温箱中培养24 h，有产酸、产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证实有大肠菌群存在。根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查后附表1“大肠菌群检数表”，报告每升水样中的大肠菌群数。

● 水源水

（1）于各装有5 ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入10 ml水样；于各装有10 ml乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1 ml水样；再于各装有10 ml乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1 ml 1∶10稀释的水样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37 ℃恒温箱内培养24 h。

（2）平板分离和复发酵试验的检验步骤同“生活饮用水检验方法”。

（3）根据证实总大肠菌群存在的阳性管数，查后附表“最可能数（MPN）表”，即求得每100 ml水样中存在的总大肠菌群数。我国目前系以1 L为报告单位，故MPN值再乘以10，即为1 L水样中的总大肠菌群数。

例如，某水样接种10 ml的5管均为阳性；接种1 ml的5管中有2管为阳性；接种1∶10的水样1 ml的5管均为阴性。从最可能数（MPN）表中查检验结果5-2-0，得知100 ml水样中的总大肠菌群数为49个，故1 L水样中的总大肠菌群数为49×10=490个。

对污染严重的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应作1∶10、1∶100、1∶1 000或更高倍数的稀释，检验步骤同“水源水”检验方法。

如果接种的水样量不是10 ml、1 ml和0.1 ml，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN指数，再经下面公式换算成每100 ml的MPN值。

表5-6　大肠菌群检数表

注：接种水样总量300 ml（100 ml 2份，10 ml 10份）

表5-7　最可能数（MPN）表

续表

注：（接种5份10 ml水样、5份1 ml水样、5份0.1 ml水样时，不同阳性及阴性情况下100 ml水样中细菌数的最可能数和95%可信限值）

三、思考题

1.配制好的培养液存放时应注意哪些事项？

2.为什么说提高温度培养出的大肠菌群更能代表水质受污染的情况？