在生物质废物的厌氧消化过程中，甲烷化易受高浓度有机酸和氨的胁迫，导致工艺过程不稳定、甲烷化效率降低等问题。为明确产甲烷微生态对酸和氨胁迫的响应机制，本文利用稳定碳同位素标记示踪技术，结合使用特异性甲烷化抑制剂的方法分析甲烷化代谢途径；综合运用qPCR、FISH、ARISA和DNA-SIP技术，动态监测嗜乙酸产甲烷微生物菌群结构；再结合对代谢底物、产物和生态因子的分析，建立了多角度综合表征厌氧产甲烷微生态的创新研究方法体系。基于该方法体系，本文分别研究了关键生态因子，包括pH、乙酸浓度和氨浓度对厌氧产甲烷微生态的影响规律，探究了酸胁迫和氨胁迫下甲烷化中心理论的微生物过程机理，并探明了驯化对氨胁迫下微生态的影响及促进甲烷化代谢启动的效果，主要得到以下结论：

（1）研究了高浓度乙酸环境中，pH对产甲烷微生态的影响规律。结果发现，酸性环境下，较低的pH降低了甲烷的生成速率。在初始乙酸浓度100 mmol/L，初始pH 6.0～6.5时，甲烷主要通过乙酸发酵型途径产生，氢营养型（也称作CO2还原型）甲烷化途径的比例仅为21%～22%；而当初始pH为5.5时，乙酸氧化和氢营养型甲烷化联合途径的贡献显著增加（约为51%），同时伴随着共生乙酸氧化细菌（SAOB）丰度的升高。初始pH 5.5且暴露于甲烷化抑制剂CH3F时，甲烷可以完全通过乙酸氧化联合途径产生。乙酸氧化共生菌群在低pH胁迫下，对于乙酸向甲烷的转化起到关键作用；而在碱性环境下（pH＞7.5），pH的提高亦对甲烷化代谢产生显著抑制。pH＞8.3时，乙酸发酵型甲烷化途径完全被抑制，甲烷化主导途径转向氢营养型，说明SAOB和共生的氢营养型产甲烷菌对高pH胁迫具有更强的耐受性。

（2）研究了乙酸浓度对不同类型嗜乙酸产甲烷微生物菌群的影响。结果发现，乙酸浓度高于50 mmol/L时已对乙酸发酵型甲烷化反应产生抑制，pH的提高（pH＞7.5）促进了抑制效应，说明：高乙酸浓度和高pH对甲烷化具有协同抑制效应，尤其是对于乙酸发酵型途径。在初始乙酸浓度50～100 mmol/L时，营乙酸发酵型途径的甲烷鬃毛菌科Methanosaetaceae和甲烷八叠球菌科Methanosarcinaceae始终为优势菌群；而在初始乙酸浓度150～200 mmol/L时，随着pH的逐渐提高，SAOB和氢营养型产甲烷菌（包括甲烷微菌Methanomicrobiales和甲烷杆菌Methanobacteriales）逐渐替代乙酸发酵型产甲烷菌成为优势菌群，形成了产甲烷微生态降解高浓度乙酸的“双峰”模式特征，说明：高乙酸浓度会促使甲烷化主导途径向乙酸氧化和氢营养型甲烷化的联合反应转变。乙酸氧化共生菌群对高乙酸浓度和高pH胁迫具有更强的耐受性，但其代谢乙酸的活力却相对偏低。

（3）研究了氨浓度对中温和高温厌氧产甲烷微生态的影响规律。结果发现，氨对产甲烷反应的抑制程度随其浓度的增加而提高。随着TAN的增加，产甲烷主导途径由乙酸发酵型逐渐转向氢营养型。中温下TAN=10～214 mmol/L和高温下TAN=10～357 mmol/L时，乙酸向甲烷的转化主要通过乙酸发酵型途径进行；中温下TAN=357 mmol/L和高温下TAN=500 mmol/L时，嗜乙酸产甲烷微生物菌群处于不稳定状态，可能通过乙酸发酵型或者共生乙酸氧化和CO2还原型甲烷化联合途径降解乙酸，此时的氨浓度可称为“临界氨浓度”；中温下TAN=500～643 mmol/L和高温下TAN=643 mmol/L时，乙酸发酵型甲烷化途径完全受到抑制，经过较长迟滞期后，乙酸通过共生乙酸氧化产甲烷化途径被降解。

（4）发现了氨胁迫抑制厌氧产甲烷微生态的关键影响因子。在临界氨浓度下，pH随着CH3COO-的消耗逐渐升高，游离氨浓度随之增加，中温和高温下FAN分别提高至9～10 mmol/L和18～21 mmol/L时，乙酸发酵型甲烷化途径逐渐受到抑制，产甲烷主导途径开始转向氢营养型，表明FAN是产生氨抑制的关键因子。比较不同初始TAN的各反应器后发现，产生甲烷化途径转变的初始FAN浓度为5 mmol/L（中温）和11 mmol/L（高温），低于FAN逐渐升高过程中诱发代谢途径转变的浓度。可见，暴露于逐渐增加的氨胁迫下，乙酸发酵型产甲烷菌受到驯化，比突然暴露于高度氨胁迫时展现出了更高的胁迫耐受力。与高温厌氧消化相比，中温厌氧消化系统更容易受到氨的抑制。因此，TAN、pH和温度是影响氨胁迫程度的关键因子。

（5）研究了存在和不存在氨胁迫时，高浓度乙酸向甲烷转化的微生物过程机理。在高温氨胁迫（TAN 500 mmol/L）下，产甲烷微生态的响应过程表现为：随着FAN逐渐增加，营乙酸发酵型途径的甲烷八叠球菌Methanosarcina sp.逐渐受到抑制并消失，共生的SAOB和甲烷囊菌Methanoculleus sp.逐渐产生并成为优势种群，通过共生乙酸氧化和CO2还原型甲烷化联合途径形成新的甲烷化中心。而在无氨胁迫时，则始终为营乙酸发酵型途径的甲烷八叠球菌Methanosarcina sp.占优势；中温氨胁迫（TAN 357 mmol/L）下，产甲烷微生态的响应过程则表现为：甲烷鬃毛菌Methanosaetaceae受到抑制逐渐消失，甲烷八叠球菌Methanosarcina sp.以及乙酸氧化共生菌群（SAOB和氢营养型的甲烷囊菌Methanoculleus sp.）逐渐产生并相互竞争。而在无氨胁迫时，则始终为营乙酸发酵型途径的甲烷鬃毛菌Methanosaetaceae占优势。(www.daowen.com)

（6）比较了未驯化和驯化后的产甲烷微生态暴露于氨胁迫时的响应过程差异。基于对产甲烷微生态的动态连续监测，捕捉到了氨胁迫下未驯化微生态的结构重建过程，表现为乙酸厌氧甲烷化代谢的“双峰”模式过程特征，和优势微生物种群及其功能的交替演变。而预先的驯化过程显然削弱了原本占优势的乙酸发酵型产甲烷菌的活力，加速了耐胁迫新生功能菌群的生长和甲烷化中心的建立，也显示了氨对厌氧产甲烷菌具有慢性毒性。

（7）分析了甲烷八叠球菌Methanosarcina sp.对氨胁迫的响应机制。发现在氨胁迫下，Methanosarcina sp.趋向于形成多细胞聚合体。其代谢途径存在可变性，可通过乙酸发酵型和CO2还原型两种途径产甲烷。在预先受到驯化和较高的FAN下，更倾向于通过CO2还原型途径产甲烷。

（8）通过FISH技术观测到了不同氨胁迫状态下微生物的空间分布状况。发现微生物的聚集形态对于其胁迫的耐受性具有一定影响。颗粒污泥内的细菌和产甲烷菌呈层状分布，从而对处于颗粒内部的甲烷鬃毛菌Methanosaetaceae产生一定的保护作用，使其在FAN高达14～21 mmol/L时仍显示了较强的活力。氨胁迫下，产生于液相中共生的SAOB和氢营养型产甲烷菌有逐渐聚集形成团簇的趋势，而Methanosarcina sp.则呈现多细胞聚集式生长。可见，厌氧微生物在胁迫状态下倾向于缩短细胞间的距离。

（9）探索了应用碳同位素标记技术鉴别氨胁迫下优势微生物种群及其功能的方法。发现在使用DNA-SIP技术时，需尽量将取样时间控制在培养过程中前期。培养时间过长，则微生物间的交互营养可对功能微生物种群的判断产生干扰。在利用碳同位素标记方法识别乙酸的代谢途径时，发现与SAOB合作的氢营养型产甲烷菌所利用的无机碳来源于其生存环境，而并非仅来自乙酸氧化反应。因此，定量分析时需考虑外源性无机碳的“稀释效应”。

（10）厌氧甲烷化胁迫过程中，甲烷化代谢在嗜乙酸产甲烷微生物菌群（包括严格乙酸营养型的甲烷鬃毛菌Methanosaeta sp.、多营养型的甲烷八叠球菌Methanosarcina sp.，以及共生的SAOB和氢营养型的甲烷微菌Methanomicrobiales和甲烷杆菌Methanobacteriales）之间的竞争中进行。当暴露于不利环境时，如过高（＞8.3）或过低的pH（＜6.0）、高浓度VFAs、高浓度氨以及甲烷化抑制剂（CH3F），甲烷鬃毛菌Methanosaeta sp.最为敏感，甲烷八叠球菌Methanosarcina sp.则具有一定的耐受性，而共生的SAOB和氢营养型产甲烷菌的耐受力最高。