1.关键微生物种群丰度的变化

qPCR技术可实现对特定微生物种群数量的动态监测，为研究特定生境中关键微生物种群的分布变化以及环境因素对各微生物种群的影响提供重要信息。

处于氨胁迫下的厌氧微生态中，乙酸主要通过共生乙酸氧化和乙酸发酵型甲烷化途径降解。此过程中，严格乙酸营养型的甲烷鬃毛菌科Methanosaetaceae、多营养型的甲烷八叠球菌科Methanosarcinaceae、共生乙酸氧化细菌，以及氢营养型的甲烷杆菌目Methanobacteriales和甲烷微菌目Methanomicrobiales，在微生态的变化演替中可能起到关键作用。因此，选择细菌、甲烷杆菌目Methanobacteriales、甲烷囊菌属Methanoculleus（属于甲烷微菌目）、甲烷八叠球菌属Methanosarcina（属于甲烷八叠球菌科）和甲烷鬃毛菌科Methanosaetaceae这5个种群作为本研究的关键微生物种群。采用qPCR技术，监测了氨胁迫下5个关键微生物种群丰度的动态变化过程。由于反应体系存在固、液两相，为非均匀系统，因此，分别分析了固相污泥和液相中的微生物种群。

图7-9 TAN 500 mmol/L时高温反应器内的微生物种群丰度

高温反应器内细菌和产甲烷菌种群丰度的变化 由图7-9可以看到，TAN为500 mmol/L的高温反应器中，甲烷囊菌属Methanoculleus丰度的变化最为显著。在ATS反应器的缓慢产甲烷末期，以及NATS反应器的中间抑制前期，Methanoculleus的丰度即开始快速升高；当ATS反应器进入活跃产甲烷期，以及NATS反应器进入后活跃产甲烷期时，Methanoculleus的丰度已提高了约3个数量级，从102copies/ng-DNA提高到105copies/ng-DNA。此时，固相污泥中也出现了大量Methanoculleus，而原本占优势的甲烷八叠球菌属Methanosarcina的丰度则降低了约2个数量级，由初始的105copies/ng-DNA减少到了103copies/ng-DNA。

细菌和甲烷杆菌目Methanobacteriales为微生态中数量最多的两个类群，其丰度在产甲烷过程中略有增加。甲烷八叠球菌属Methanosarcina（液相环境）和甲烷鬃毛菌科Methanosaetaceae的丰度随时间呈现一定波动，但整体上略有降低。

由此可以确认，在高温反应器中，Methanoculleus为氨胁迫下的优势产甲烷菌种群。

中温反应器内细菌和产甲烷菌种群丰度的变化 如图7-10所示，TAN为357 mmol/L时，中温反应器内的甲烷囊菌属Methanoculleus和甲烷八叠球菌属Methanosarcina的数量均有显著增加。AMS_N5（4）中，到活跃产甲烷阶段中期，Methanosarcina和Methanoculleus在液相中的丰度均增加了约4个数量级，从10 copies/ng-DNA增加到105copies/ng-DNA；Methanoculleus在固相污泥中的丰度由起始时的未检出，增加到103copies/ng-DNA；Methanosarcina的丰度也增加了近30倍。NAMS_N5（4）中，在前活跃产甲烷期，各微生物种群并无显著变化；进入中间抑制期后，Methanoculleus和Methanosarcina的数量开始增加；到后活跃产甲烷期时，Methanoculleus在固相中的丰度由前活跃产甲烷期的极低值（＜1 copy/ng-DNA），增加到了104～105copies/ng-DNA，其在液相中的丰度则增加了3个数量级；同时，Methanosarcina的丰度也发生了近2个数量级的变化。

图7-10 TAN 357 mmol/L时中温反应器内的微生物种群丰度

在中温反应器内，细菌和甲烷杆菌目Methanobacteriale同样为数量最多的两个类群，其丰度在产甲烷过程中略有增加；甲烷鬃毛菌科Methanosaetaceae的丰度呈现一定的波动，但在培养后期显著降低。

由此可见，中温反应器内，Methanosarcina和Methanoculleus在氨胁迫下的甲烷化代谢中起到关键作用。对于驯化后的污泥AMS，Methanosarcina与Methanoculleus共同成为活跃产甲烷期的优势产甲烷菌种群；而未经驯化的污泥NAMS中，Methanoculleus的变化比Methanosarcina更为剧烈。

2.功能微生物种群的FISH观测结果

FISH技术不仅可以提供目标微生物种群的代谢活力信息，还可实现原位观测活性微生物种群的存在形态和空间分布状况。本研究采用FISH方法观测了关键微生物种群，包括细菌、甲烷八叠球菌科Methanosarcinaceae、甲烷微菌目Methanomicrobiales、甲烷鬃毛菌科Methanosaetaceae和甲烷杆菌目Methanobacteriales的分布变化。

氨胁迫下驯化的高温微生态 图7-11显示了ATS-N7（4）反应器内功能微生物种群的变化过程。在驯化后的ATS污泥中，存在大量甲烷八叠球菌科Methanosarcinaceae的多细胞聚集体（图7-11（a），（b），（c）蓝色）。在迟滞期和缓慢产甲烷期，检测到Methanosarcinaceae的明亮信号；随后，信号强度逐渐减弱。进入活跃产甲烷期后，Methanosarcinaceae的信号完全消失；同时，杆状细菌（图7-11（d），（e），（f）红色）和球形甲烷微菌Methanomicrobiales（图7-11（d），（e），（f）蓝色）开始大量产生。到活跃产甲烷期和稳定期，细菌和Methanomicrobiales已完全取代Methanosarcinaceae，成为优势微生物种群。

图7-11 ATS-N7（4）内液相中微生物的FISH观测结果

注：各微生物样品FISH所用探针为：
（a）Arc915-FITC绿色；MS1414-Cy5蓝色；Mx825 mix-Cy3红色；
（b）Arc915-FITC绿色；MS1414-Cy5蓝色；Mx825 mix-Cy3红色；
（c）Arc915-FITC绿色；MS1414-Cy5蓝色；Mx825 mix-Cy3红色；
（d）Arc915-FITC绿色；MG1200-Cy5蓝色；EUB338 mix-Cy3红色；MS1414-Cy3红色；
（e）Arc915-FITC绿色；MG1200-Cy5蓝色；EUB338 mix-Cy3红色；MS1414-Cy3红色；
（f）Arc915-FITC绿色；MG1200-Cy5蓝色；EUB338 mix-Cy3红色；MS1414-Cy3红色。

氨胁迫下未驯化的高温微生态 如图7-12所示，NATS-N7（4）反应器中，未驯化的微生态NATS显示了相似的变化规律。但与ATS不同的是，在培养起始阶段，液相中的Methanosarcinaceae[蓝色，图7-12（a），（b）]呈现单细胞悬浮状态；随后，单细胞迅速聚集，形成大量多细胞团簇，成为前活跃产甲烷期的功能微生物；进入中间抑制期后，Methanosarcinaceae的信号[黄色，图7-12（c）]仅维持了一段时间，之后就逐渐消失；细菌[蓝色，图7-12（d）；红色，图7-12（e），（f）]和Methanomicrobiales[黄色，图7-12（d）；蓝色，图7-12（e），（f）]开始产生，并成为后活跃产甲烷期的优势微生物种群。

图7-12 NATS-N7（4）内液相中微生物的FISH观测结果

注：各微生物样品FISH所用探针为：
（a）Arc915-FITC绿色；MS1414-Cy5蓝色；Mx825 mix-Cy3红色；
（b）Arc915-FITC绿色；MS1414-Cy5蓝色；Mx825 mix-Cy3红色；
（c）Arc915-FITC绿色；MS1414-Cy3红色；Mx825 mix-Cy3红色；MG1200-Cy5蓝色；
（d）Arc915-FITC绿色；MG1200-Cy3红色；EUB338 mix-Cy5蓝色；
（e）Arc915-FITC绿色；MG1200-Cy5蓝色；EUB338 mix-Cy3红色；MS1414-Cy3红色；
（f）Arc915-FITC绿色；MG1200-Cy5蓝色；EUB338 mix-Cy3红色；MS1414-Cy3红色。(www.daowen.com)

由此可见，高温反应器中，在氨胁迫下，随着乙酸逐渐被消耗，互营共栖的细菌和甲烷微菌目Methanomicrobiales逐渐取代甲烷八叠球菌Methanosarcinaceae，成为优势微生物种群。而预培养驯化过程加速了微生态的此种转变。根据已有研究结果推测，新生的杆状细菌即为高温共生乙酸氧化细菌（SAOB）。可见，与Methanosarcinaceae相比，SAOB和甲烷微菌目Methanomicrobiales具有更高的氨胁迫耐受性。

中温颗粒污泥内的微生态 根据FISH观测结果可以发现，在中温颗粒污泥内，细菌和产甲烷菌呈层状分布，最外层为细菌（红色），次外层为产甲烷菌[绿色，图7-13（a），（c）]，其中大部分为甲烷鬃毛菌Methanosaetaceae[黄色，图7-13（b），（e），（f）]。在以细菌为主的外层，还存在少量甲烷微菌目Methanomicrobiales的球形细胞[蓝色，图7-13（a）—（f）]。

在低氨浓度下培养后，颗粒内微生物的分布未发生显著变化[图7-13（b），（e）]。

在高氨浓度下，未驯化的NAMS污泥内，中间抑制期前，颗粒内微生物的分布仍然为细菌和Methanosaetaceae的双层结构；而进入后活跃产甲烷期时，颗粒内细菌和Methanosaetaceae的信号基本消失，仅检测到甲烷微菌目Methanomicrobiales和少量细菌的信号[图7-13（d）]。而在驯化的AMS污泥中，活跃产甲烷期时，颗粒内的细菌和Methanosaetaceae展示了较强的信号；其最外层中，Methanomicrobiales的数量显著增加。

图7-13 中温反应器颗粒污泥内微生物的FISH观测结果。各反应器编号同上

注：各微生物样品FISH所用探针为：
（a）Arc915-FITC绿色；MG1200-Cy5蓝色；Eub338 mix-Cy3红色；
（b）Arc915-FITC绿色；Eub338 mix-Cy3红色；MG1200-Cy5蓝色；Mx825 mix-Cy3红色；
（c）Arc915-FITC绿色；MG1200-Cy5蓝色；Eub338 mix-Cy3红色；
（d）Arc915-FITC绿色；MG1200-Cy5蓝色；Eub338 mix-Cy3红色；
（e）Arc915-FITC绿色；Eub338 mix-Cy3红色；MG1200-Cy5蓝色；Mx825 mix-Cy3红色；
（f）Arc915-FITC绿色；Eub338 mix-Cy3红色；MG1200-Cy5蓝色；Mx825 mix-Cy3红色。

氨胁迫下驯化的中温微生态 图7-14显示，在AMS-N5（4）反应器中，缓慢产甲烷期（0～13 d），液相中存在高浓度的甲烷鬃毛菌Methanosaetaceae[绿色，图7-14（a）—（c）]和少量细菌[红色，图7-14（a）—（c）]；培养至第26 d时，产甲烷反应基本停滞，代表微生物的荧光信号也几乎消失；进入活跃产甲烷期后（第56 d），液相中出现大量甲烷八叠球菌科Methanosarcinaceae的多细胞聚集体[黄色，图7-14（d）—（f）]，其直径均大于50μm；同时，还观测到少量杆状细菌[红色，图7-14（d）—（f）]。在活跃产甲烷后期和稳定期（第65 d）时，细菌和甲烷微菌目Methanomicrobiales[蓝色，图7-14（d）—（f）]的数量显著增加，而甲烷八叠球菌科Methanosarcinaceae多细胞聚集体的数量明显减少，其直径也缩小至5 μm左右。

图7-14 AMS-N5（4）内液相中微生物的FISH观测结果

注：各微生物样品FISH所用探针为：
（a）Arc915-FITC绿色；MS1414-Cy5蓝色；EUB338 mix-Cy3红色；
（b）Arc915-FITC绿色；MS1414-Cy5蓝色；EUB338 mix-Cy3红色；
（c）Arc915-FITC绿色；MS1414-Cy5蓝色；EUB338 mix-Cy3红色；
（d）Arc915-FITC绿色；MG1200-Cy5蓝色；MS1414-Cy3红色；EUB338 mix-Cy3红色；
（e）Arc915-FITC绿色；MG1200-Cy5蓝色；MS1414-Cy3红色；EUB338 mix-Cy3红色；
（f）Arc915-FITC绿色；MG1200-Cy5蓝色；MS1414-Cy3红色；EUB338 mix-Cy3红色。

氨胁迫下未驯化的中温微生态 如图7-15所示，在NAMS-N5（4）反应器中，前活跃产甲烷期（0～13 d），液相中存在大量产甲烷鬃毛菌Methanosaetaceae（绿色，图7-14 a—c）与少量短杆和球状细菌[红色，图7-14（a）—（c）]；进入中间抑制期（34 d）后，产甲烷反应基本停滞，荧光信号几近消失；随着产甲烷活力逐渐恢复，细菌[蓝色，图7-15（d）；红色，图7-15（e），（f）]和甲烷微菌Methanomicrobiales[黄色，图7-15（d）；蓝色，图7-15（e），（f）]快速增殖，并成为后活跃产甲烷期的优势种群；在后活跃产甲烷期的起始阶段，也观测到了Methanosarcinaceae的信号[绿色，图7-15（d）]，但随着细菌和甲烷微菌目Methanomicrobiales数量的急剧增加，其信号逐渐消失。

图7-15 NAMS-N5（4）内液相中微生物的FISH观测结果

注：各微生物样品FISH所用探针为：
（a）Arc915-FITC绿色；MS1414-Cy5蓝色；EUB338 mix-Cy3红色；
（b）Arc915-FITC绿色；MS1414-Cy5蓝色；EUB338 mix-Cy3红色；
（c）Arc915-FITC绿色；MS1414-Cy5蓝色；EUB338 mix-Cy3红色；
（d）Arc915-FITC绿色；MG1200-Cy3红色；EUB338 mix-Cy5蓝色；
（e）Arc915-FITC绿色；MG1200-Cy5蓝色；MS1414-Cy3红色；EUB338 mix-Cy3红色；
（f）Arc915-FITC绿色；MG1200-Cy5蓝色；MS1414-Cy3红色；EUB338 mix-Cy3红色。

由此可见，在中温反应器中，氨胁迫下，随着乙酸逐渐被消耗，甲烷八叠球菌科Methanosarcinaceae与互营共栖的细菌和甲烷微菌快速生长，逐渐取代甲烷鬃毛菌科Methanosaetaceae成为优势微生物种群。驯化后的AMS微生态中，甲烷八叠球菌科Methanosarcinaceae在氨胁迫下的甲烷化启动过程中起到更重要的作用；而在未驯化的NAMS微生态中，共生的细菌和甲烷微菌成为更关键的嗜乙酸产甲烷微生物种群。Methanosarcinaceae仅在后活跃产甲烷初期出现。此种差异，可能与驯化或者NAMS反应器中更高的FAN浓度相关。

图7-16 TAN 10 mmol/L时液相中微生物的FISH观测结果。反应器编号同上

注：各微生物样品FISH所用探针为：
（a）Arc915-FITC绿色；MS1414-Cy5蓝色；Mx825 mix-Cy3红色；
（b）Arc915-FITC绿色；MS1414-Cy5蓝色；Mx825 mix-Cy3红色；
（c）Arc915-FITC绿色；MS1414-Cy5蓝色；EUB338 mix-Cy3红色；
（d）Arc915-FITC绿色；MS1414-Cy5蓝色；EUB338 mix-Cy3红色。

无氨胁迫下的厌氧微生态 TAN为10 mmol/L的各反应器中，乙酸厌氧甲烷化过程中，均未出现功能微生物种群的演变。由图7-16可知，高温环境中，甲烷八叠球菌科Methanosarcinaceae[蓝色，图7-16（a），（b）]为活跃产甲烷期的优势功能微生物种群；中温环境中，甲烷鬃毛菌科Methanosaetaceae[绿色，图7-16（c），（d）]始终为优势产甲烷菌，而细菌[红色，图7-16（c），（d）]也大量存在于液相体系中。

氨胁迫下功能菌群的聚集形态 由以上分析可知，Methanoculleus（属于Methanomicrobiales）和Methanosarcina（属于Methanosarcinaceae）为氨胁迫下的功能产甲烷菌。结合对氨浓度的分析可见，中温下，FAN达到14～21 mmol/L时，Methanosarcina倾向形成多细胞聚集体；而FAN达到36～43 mmol/L时，Methanoculleus则与SAOB趋向汇集成为细胞团簇。高温下，两种聚集形态的功能菌群可耐受的FAN范围则分别约为29～50 mmol/L和43～107 mmol/L。