1.高温反应器内的产甲烷途径

图7-7显示了各高温反应器内气相稳定碳同位素含量的变化。

CH3COOH培养实验 TAN为500 mmol/L的ATS_N7（1，2）反应器中，缓慢产甲烷期时，气相的δ13CH4和δ13CO2分别为-71.3‰～-74.7‰和-7.7‰～-13.1‰（图7-7 a），此时的αc约为1.070（图7-7 c）。当进入活跃产甲烷期后，δ13CH4快速下降（最低值-89.0‰），δ13CO2则持续升高，αc随之增加，最高值达到1.095。可见，ATS_N7（1，2）中的甲烷化反应存在较高的碳同位素分馏效应，甲烷主要通过CO2还原型途径产生。而进入活跃产甲烷期后，碳同位素分馏效应上升到极高水平，指示功能产甲烷菌种群可能发生了变化。

TAN为10 mmol/L的ATS_N0.14（1）中，αc由缓慢产甲烷期的1.067下降到活跃产甲烷期1.007，进入稳定期后又急剧增加至1.073。可见，ATS_N0.14（1）中的甲烷主要通过乙酸发酵型途径产生，而当乙酸几乎被耗尽时，产甲烷途径转向氢营养型。

[2-13C]CH3COOH培养实验 通过观测[2-13C]CH3COOH降解过程中，13C代谢产物的产生情况，亦可判断乙酸的降解途径。在ATS_N7（3）反应器中，迟滞期和缓慢产甲烷期，13CH4的含量由初期的80.6%逐渐降低，而13CO2的含量则由1.0%逐渐提高；进入活跃产甲烷期后，两者均稳定在30%左右[图7-7（e）]。由此可见，迟滞期和缓慢产甲烷期，乙酸发酵型途径产生的甲烷的含量由初始的80%逐渐减少，通过乙酸氧化生成的CO2则在增加；进入活跃产甲烷期后，乙酸完全通过氧化降解，甲烷则完全通过CO2还原途径生成。

在ATS_N0.14（3）中，活跃产甲烷期，13CH4的含量高于95%，13CO2的含量则低于1.5%；进入稳定期后，13CH4含量迅速降低，13CO2含量随之提高，表明主导产甲烷途径已由活跃产甲烷期的乙酸发酵型转向稳定期的CO2还原型。

图7-7 各高温反应器的δ13CH4和δ13CO2、13CH4和13CO2含量与αc

NaH13CO3培养实验 通过标记外源性无机碳，13CH4的含量即可用于指示CO2还原型甲烷化反应中C的来源（乙酸氧化反应或者环境中的CO2）。因此，在ATS_N7（5）反应器中，采用50%NaH13CO3进行了无机碳标记，并监测了标记物在代谢产物中的分布。发现在迟滞期和缓慢产甲烷期，13CH4的含量由初始的3.2%逐渐增加，13CO2含量则由34.0%逐渐减少；进入活跃产甲烷期后，13CH4和13CO2的含量均稳定于15%左右[图7-7（g）]。可见，随着共生乙酸氧化和CO2还原型甲烷化联合途径比重的提高，外源性无机碳对产甲烷反应的贡献逐渐增加。由此表明，氢营养型产甲烷菌以液相环境中的碳酸盐和CO2为碳源，进行甲烷化代谢。另外，以[2-13C]CH3COOH为基质的ATS_N7（3）反应器中，当共生乙酸氧化联合途径为主导产甲烷途径时，代谢产物中的13CH4和13CO2含量相等，但小于50%。该现象也证明，外源性的无机碳和其他生化反应生成的CO2，可稀释共生乙酸氧化反应中产生的CO2。

在ATS_N0.14（5）反应器中，气相13CH4和13CO2含量的变化规律显示：在活跃产甲烷期，甲烷主要通过乙酸发酵型途径产生；进入稳定期后，共生乙酸氧化和氢营养型甲烷化联合途径成为主导代谢途径。

由以上分析过程可以发现，在各ATS_N7反应器内，活跃产甲烷期的甲烷化代谢均通过共生乙酸氧化联合途径进行。而缓慢产甲烷期的代谢方式则存在一定差异，即：ATS_N7（1，2）中为共生乙酸氧化联合途径主导。ATS_N7（3，5）中则为：初始时，乙酸发酵型途径占优势；随着甲烷化速率的增加，共生乙酸氧化联合途径的比例逐渐提高。可见，在临界氨浓度下，产甲烷微生态的功能处于不稳定状态。(www.daowen.com)

按照以上方法分析NATS反应器的甲烷化代谢过程，结果表明：TAN为500 mmol/L时，在前活跃产甲烷期，甲烷主要通过乙酸发酵型途径生成；进入中间抑制期后，主导产甲烷途径开始转向共生乙酸氧化联合途径；在后活跃产甲烷期，甲烷完全通过共生乙酸氧化联合途径产生。TAN为10 mmol/L时，在活跃产甲烷期，甲烷化代谢主要通过乙酸发酵型途径进行；进入稳定期后，共生乙酸氧化和氢营养型甲烷化联合途径的贡献显著增加[图7-7（b），（d），（f），（h）]。

2.中温反应器内的产甲烷途径

图7-8显示了各中温反应器内气相稳定碳同位素含量的变化。据此，采用天然稳定碳同位素指纹识别技术以及有机碳和无机碳同位素标记技术，综合分析了AMS和NAMS反应器内乙酸甲烷化代谢途径的演变规律。

TAN为357 mmol/L时，AMS接种的5个反应器中的甲烷化代谢过程出现一定的差异，如AMS_N5（2，4）的活跃产甲烷期比AMS_N5（1，3，5）更早出现。AMS_N5（2）中，乙酸发酵型甲烷化代谢占优势，进入稳定期后，主导代谢途径转向共生乙酸氧化联合途径；而在AMS_N5（1）和AMS_N5（3，5）中，缓慢产甲烷期的主导产甲烷途径为乙酸发酵型；过渡到活跃产甲烷期后，共生乙酸氧化联合途径的比例逐渐提高；进入稳定期后，共生乙酸氧化联合途径成为主导代谢途径[图7-8（a），（c），（e），（g）]。而TAN为10 mmol/L时，AMS_N0.14中的甲烷主要通过乙酸发酵型途径产生；进入稳定期后，共生乙酸氧化联合途径的贡献则显著增加。

NAMS反应器采用未驯化污泥接种。其产甲烷过程和代谢途径的变化规律与NATS反应器相似，即：TAN为357 mmol/L时，在前活跃产甲烷期，甲烷主要通过乙酸发酵型途径生成；进入中间抑制期后，主导产甲烷途径开始转向共生乙酸氧化联合途径；在后活跃产甲烷期，甲烷完全通过共生乙酸氧化联合途径产生。TAN为10 mmol/L时，在活跃产甲烷期，乙酸发酵型途径为产甲烷主导途径；进入稳定期后，共生乙酸氧化联合途径的比例显著提高[图7-8（b），（d），（f），（h）]。

图7-8 各中温反应器的δ13CH4和δ13CO2、13CH4和13CO2含量与αc

由以上分析结果可知，在临界氨浓度下，以驯化微生态接种的反应器内，缓慢产甲烷期的乙酸主要通过乙酸发酵型途径被降解；随后，共生乙酸氧化联合途径逐渐取代乙酸发酵型途径，成为活跃产甲烷期乙酸被快速降解的主导途径。而以未驯化微生态接种的反应器内，在前活跃产甲烷期，乙酸通过乙酸发酵型途径被部分降解；进入中间抑制期后，共生乙酸氧化联合产甲烷反应开始发生；在后活跃产甲烷期，共生乙酸氧化联合途径成为残余乙酸降解的主导途径。在低氨浓度下，各反应器内的乙酸均主要通过乙酸发酵型途径被降解；当乙酸几乎被耗尽时，产甲烷主导途径则转向氢营养型。

3.代谢途径分析的方法学探讨

本文对相同培养环境下的各反应器，分别采用天然稳定碳同位素指纹识别技术和有机碳（乙酸甲基碳标记）、无机碳同位素标记技术，识别乙酸的厌氧代谢途径。尽管各反应器的甲烷化代谢过程略有差异，不同分析方法所显示的结果却基本吻合。可见，上述方法间能够互相印证。这也证明了天然稳定碳同位素指纹技术识别厌氧产甲烷途径或乙酸降解途径的有效性。