当乙酸浓度降低到限制浓度时，检测到的累计甲烷产量为0.52～0.58 mmol-CH4/mmol-Cadded，略高于理论的化学计算产量。当乙酸浓度高于1 mmol/L时，采用[1，2-13C]CH3COONa为底物的标记实验中，检测到的13CH4占总CH4产生量的94%～96%，而13CO2则在生成的CO2中占93%～94%（图6-5）。这表明，超过94%的CH4和超过93%的CO2产生于外加的乙酸碳源，大部分（＞99%）乙酸通过甲烷化过程被转化。当乙酸浓度降低到1 mmol/L以下时，13CH4和13CO2的百分比迅速下降，说明其非乙酸碳源的甲烷化开始变得显著，如内源呼吸效应和微生物间的交互营养现象，由此产生12CH4和12CO2导致对13C标记气体的稀释作用。内源呼吸效应在未添加乙酸的空白实验中已得到验证。在培养前期产甲烷过程处于指数增长期时，内源呼吸和交互营养现象并不显著。

图6-513C标记各反应器的δ13CH4和δ13CO2(www.daowen.com)

注：图中数据点为3平行实验的平均值，误差线表示标准偏差。

在TAN为19 mmol/L和500 mmol/L下的整个培养过程中，各选择了3个阶段的污泥样品进行了不同密度DNA的分级分离。随着乙酸浓度持续降低，内源呼吸和交互营养现象逐渐变得显著。因此，在后续的通量测序和序列分析中，仅在标记实验中，选择了乙酸浓度较高（约50 mmol/L，处于活跃产甲烷期）时的DNA进行测试和分析，包括分离得到的4个DNA组分，即：TAN 19 mmol/L标记实验培养5 d后，累计产甲烷量达到75%时的轻DNA组分L-D_L5和重DNA组分H-D_L5；TAN 500 mmol/L标记实验培养9 d后，累计产甲烷量达到50%时的轻DNA组分L-D_H9和重DNA组分H-D_H9。其中，轻DNA组分中的C基本为12C，其序列信息代表了在体系中原本存在，但在乙酸的快速转化过程中不活跃的微生物群体；重DNA组分中的C大部分为13C，其序列信息代表了在乙酸的快速转化过程中活跃的微生物群体。