由以上分析可知，乙酸氧化和氢营养型甲烷化的联合途径在低pH酸胁迫下的甲烷化启动过程中起到关键作用。随着初始pH的降低，该途径所占的比例逐渐增加，由此推测，共生乙酸氧化细菌可能对酸胁迫具有较强的耐受性。为进一步验证共生乙酸氧化细菌在各研究体系中的分布，采用qPCR技术对其在不同培养条件下的丰度进行了定量分析。

针对共生乙酸氧化细菌，采用了基于功能基因的qPCR技术，以该类细菌持有的编码甲酰四氢叶酸合成酶（FTHFS）和乙酰辅酶A合成酶（ACS）的基因设计引物，作为其生物标记物进行定量分析。FTHFS和ACS本来是厌氧乙酸化过程中一氧化碳还原酶/乙酸辅酶A（CODH/acetyl-Co A）途径的关键酶种。目前已分离培养并实现分类学鉴定的乙酸氧化细菌大部分属于同型产乙酸菌（包括C.ultunense，S.schinkii，T.phaeum和T.acetatoxydans）。它们既可利用CODH/acetyl-Co A的生物化学体系将H2/CO2还原成乙酸，称为还原型CODH/acetyl-Co A途径；又可逆向利用这一体系，将乙酸氧化为H2/CO2，称为氧化型CODH/acetyl-Co A途径。两种反应利用了相同的酶体系。因此，尽管以FTHFS和ACS基因为目标设计的FTHFS-set和ACS-set引物原本是被用于标记产乙酸菌，但共生乙酸氧化细菌同样可以被检测到。由于本实验体系以乙酸为单一碳源，共生乙酸氧化细菌为唯一可利用该底物的乙酸菌群，故FTHFS和ACS基因丰度的改变可指示乙酸氧化细菌的数量变化。

如图3-3所示，接种污泥内ACS基因的丰度为265 copies/ng-DNA。培养末期，pH为5.5的反应器内，ACS基因丰度显著增加，达到5.1×103copies/ng-DNA；而在pH 6.0时，则增加到1.1×103copies/ng-DNA。在pH 6.5和5.0的反应器内，ACS基因丰度则分别下降到47和23 copies/ng-DNA。FTHFS基因的丰度比ACS基因高2～3个数量级，而且在不同初始pH下变化幅度较小，但相比之下，仍然是pH 5.5反应体系的丰度最高。

由此可以推测，在初始pH 5.5的体系内，乙酸氧化共生菌群快速生长。而在初始pH 5.0时，100 mmol/L乙酸和低pH产生的酸胁迫抑制了大部分微生物的活力，包括共生乙酸氧化细菌（表现为ACS丰度在培养周期内的降低）。总的来说，qPCR结果所显示的乙酸氧化细菌丰度的变化与稳定同位素示踪技术指示的代谢途径变化规律相吻合。

图3-3 不同pH各反应器内ACS和FTHFS的基因丰度(www.daowen.com)

注：ACS/FTHFs表示两种基因的丰度比值。比值图中数据点为2平行测试的平均值，误差线表示数值范围

同为乙酸菌的标记物，FTHFS基因丰度却始终高于ACS基因，这可能源于两种引物的特异性和敏感度差异。FTHFS-set引物难以屏蔽来自硫酸盐还原细菌、某些产甲烷菌和其他非产乙酸细菌的FTHFS基因。另外，不同生存环境下功能基因的转录水平不同，使得基因的拷贝数和细胞浓度或活性之间存在差异。这些因素都可能导致FTHFS-set引物的特异性劣于ACS-set引物[168]。

目前，针对甲烷化中心理论已有数种假设。Mummey等人[130]根据对土壤产甲烷菌群的研究提出，不均匀分布的局部的中性pH区域可作为甲烷化启动中心。而Staley等人[99]则根据对模拟厌氧填埋柱中生物质废物的降解过程，提出反应前沿波理论，认为耐酸毒性的巴氏甲烷八叠球菌Methanosarcina barkeri可形成中性pH的反应前沿面，并逐渐向低pH区域扩展。Vavilin等人[38]则提出，在城市生活垃圾厌氧消化过程中甲烷八叠球菌可形成多细胞聚集体，以抵抗高浓度VFAs的抑制，进而形成甲烷化中心。在本研究中，天然稳定碳同位素示踪和基于功能基因的qPCR结果均显示，乙酸氧化共生菌群可作为低pH酸胁迫下甲烷化中心形成的另一种机制。此观点也得到了Kotsyurbenko等人[70]和Qu等[5]的研究结果的支持。

由于使用了颗粒态污泥作为接种污泥，本研究中微生物针对胁迫的响应行为具有一定的特异性。微生物的层状颗粒态结构分布使其对各种环境胁迫具有较强的耐受性，进而显著提高了游离态乙酸的抑制浓度阈值。