定期从反应器内采集污泥，于厌氧操作平台内完成采集过程。污泥采集后，保存于-80℃冰箱。采用PowerSoil DNA提取试剂盒（MoBio Laboratories Inc.，CA.，U.S.A.）提取生物样品中的DNA，采用Quanti TTM dsDNaHS分析试剂盒（Invitrogen）测试获取DNA的浓度，测试范围为0.2～100 ng/μL，在Qubit®2.0荧光仪（Invitrogen）上读取浓度值。

SIP实验中采用氯化铯密度梯度超速离心法分离13C-DNA和12C-DNA。本实验中使用了超高速离心机（OptimaTMUltracentrifuge，Beckman Coulter Inc.，California，U.S.A.），配套TLA-120.2型转子和2 mL快速密封异质同晶聚合物薄壁管（Quick-Seal polyallomer tubes）。具体操作步骤如下：

（1）按照表2-13配制浓度为0.978 g/mL的CsCl溶液，手温或30℃加热，温和地混匀溶液，直到CsCl（99.9%，Sigma-Aldrich）完全溶解。

表2-13 DNA-SIP实验中CsCl溶液配置

（2）用Abe折光仪测试CsCl溶液的折光系数，其折光系数应在1.401 0到1.402 0之间。若低于1.401 0，需向溶液中加入少量CsCl，若高于1.402 0，则需增加TE溶液的量。

（3）将含有500 ng DNA的溶液加入2 mL薄壁管中，用2.5 mL注射器将约2 mL的CsCl溶液注入管内。

（4）利用CsCl溶液严格配平各个离心管，并充满整个离心管，使转子内对称放置的2管的质量差不高于0.002 g。然后，密封离心管，装入转子。

（5）20℃，在65 000 r/min下离心22 h。

（6）离心结束后，去真空，小心取出离心管。

（7）用配套的剪刀将离心管顶部密封头除去，置于Beckman分级回收系统（Fraction Recovery System）上，分级分离各DNA组分。(www.daowen.com)

（8）采用同样的方法，对未添加标记物的对照实验中取得的样品进行分级。

图2-5 SIP实验中超速离心后DNA的分级

（9）采用Abe折光仪测试每个DNA组分的折光率，根据式（2-3）计算其密度：

（10）同时，采用Quanti TTM dsDNaHS试剂盒（Invitrogen）和Qubit®2.0荧光仪测试DNA浓度。

（11）以收集到的各DNA组分（包括取自SIP实验和未标记对照实验的样品）的密度（g/cm3）为横坐标，以DNA浓度为纵坐标作图。

（12）根据以上作图中SIP实验和未标记对照实验的DNA在不同密度组分中分布的差异，区分13C-DNA和12C-DNA。

（13）将13C-DNA组分和12C-DNA组分分别汇集于MicroCon YM-30 DNA纯化柱（Millipore）内，以14 000 g的转速离心30 min，将DNA从CsCl溶液中分离。

（14）将纯化后的DNA溶解于40μl Tris-HCl缓冲液（0.01 mmol/L，pH 7.5）中，于-20℃保存备用。