对于液体样品，将装有约1.5 mL液体样品的Eppendorf管置于离心机上，于4℃下以13 400 r/min的转速离心10 min后，弃去上清液，管内沉淀物即包含了液相中的微生物絮体和悬浮细胞，此沉淀物用于后续的FISH实验。实验流程包括样品固定、杂交和观测。具体方法如下：

1.固定

（1）向管内加入500μL磷酸盐缓冲溶液（1×PBS），振荡使沉淀物悬浮。

（2）再加入1 500μL 4%的多聚甲醛（PFA）溶液，微振荡使溶液混合均匀。

（3）在4℃下培养3 h。

（4）离心（13 400 r/min，5 min）后，移除上清液。

（5）加入500μL PBS溶液洗沉淀物，离心（13 400 r/min，5 min）后，移除上清液。

（6）再加入500μL PBS溶液使沉淀物悬浮，加入500μL乙醇（95%）混合后，放入-20℃冰箱保存。

2.杂交

（1）取5～10μL已固定的样品，置于载玻片（30-154H-Green-CE24，Thermo Scientific，U.S.A.）小孔内，于46℃下烘干10 min；

（2）配置杂交缓冲液，每mL杂交缓冲液包括：180μL的5 mol/L NaCl，20μL的1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0），一定浓度的甲酰胺溶液800 μL（表2-10）和10%SDS溶液2μL。

表2-10 杂交缓冲溶液配置

（3）将烘干的载玻片依次放入50%、80%和96%的乙醇中脱水，每次停留3 min，同时取出并解冻FISH探针。

（4）在载玻片上已脱水的样品上滴加10μL杂交缓冲液和各种探针溶液各1μL（探针浓度约50 ng/μL）。

（5）将载玻片放入50 mL杂交培养管（Falcon tube）。

（6）准备一块滤纸，将其用剩余杂交缓冲液润湿后放入培养管中，旋紧管盖，以防止样品上缓冲液中水分的流失。

（7）46℃下培养2 h或过夜。

（8）配置50 mL清洗缓冲液，其中包含1 mL的1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）和50μL的10%SDS溶液，以及一定量的甲酰胺、5 mol/L NaCl和0.1 mol/L EDTA溶液（表2-11），用灭菌蒸馏水填充到50 mL，放入50 mL离心管（BD tube）中，并将装有清洗缓冲液的离心管放入48℃水浴内加热。

表2-11 清洗缓冲溶液配置

（9）杂交结束后，用清洗缓冲液小心冲去载玻片上的杂交液，然后将载玻片放入装有清洗缓冲液的离心管中，再放入48℃水浴内培养15 min。(www.daowen.com)

（10）取出载玻片，用蒸馏水清洗掉缓冲液，并用压缩空气吹干载玻片上的残余水分。

（11）在样品上方滴一滴抗荧光衰退封片剂（CitiFluorTMAF1，Citifluor Ltd.，U.K.），加上盖玻片，即可观测。

3.观测

将载玻片放到荧光共聚焦显微镜（Axiovert 200M，Zeiss，Germany）上进行观测（图2-3）。图像处理软件为Zen Light Edition。

图2-3 荧光共聚焦显微镜观测

本文FISH实验中所用探针信息见表2-12。

4.颗粒污泥切片处理方法

另外，对于颗粒污泥样品，需首先进行切片处理后，方可进行杂交实验，具体方法如下：

（1）固定后的颗粒污泥依次分别在50%、80%和100%的乙醇中脱水10 min。

（2）分别在乙醇/二甲苯（50∶50，V/V）混合液和二甲苯（100%）中浸泡20 min。

（3）浸入二甲苯/石蜡（50∶50，V/V）混合液中30 min，之后转移到液态石蜡（Sigma）中2 h。液态石蜡熔点为54℃～56℃。

表2-12 FISH 探针

（4）将浸透石蜡的颗粒污泥放入装满液态石蜡的模子中，小心浸入冷水中使石蜡固化。

（5）将固定于石蜡中的颗粒污泥采用显微镜用切片机（RM2255，Leica）切成10～20μm厚的薄片（图2-4），用镊子置于载玻片（Poly-LLysine coated，Polysciences，Germany）上的水滴中。

（6）将载有切片样品的载玻片放入42℃恒温箱放置30 min，直至切片展平，并贴附于覆有多聚赖氨酸的载玻片上。

图2-4 石蜡包埋的颗粒污泥的切片过程

（7）将固定了样品的载玻片置于二甲苯（100%）中10 min，并重复3次。取出后于室温下放置，直至二甲苯完全挥发。