1.qPCR反应体系

为监测关键微生物种群的动态变化，将基于16S rRNA基因设计的引物作为生物标记物，采用Taqman qPCR技术定量分析不同微生物类群，包括氢营养型的甲烷杆菌目Methanobacteriales（MBT-set）和甲烷微菌目Methanomicrobiales（MMB-set），严格乙酸营养型的甲烷鬃毛菌科Methanosaetaceae（Mst-set）和多营养型的甲烷八叠球菌科Methanosarcinaceae（Msc-set），以及总细菌Bacteria（BAC-set）和古菌Archaea（ARC-set）。其中，还采用SYBR Green方法检测了甲烷囊菌属（Methanculleus-set）和甲烷八叠球菌属（Methanosarcina-set）的数量。另外，将基于功能基因设计的引物FTHFS-set和ACS-set作为生物标记物，定量化分析了共生乙酸氧化细菌的丰度。qPCR中所使用的引物和探针信息见表2-6。

Taqman方法中使用了IQTMSupermix试剂盒（BioRad，U.S.A.），而SYBR Green方法中使用了IQTMSYBR®Green Supermix试剂盒（BioRad，U.S.A.）作为反应缓冲液（其中已包含PCR所需酶和各种离子）。反应体积为15μL，Taqman qPCR反应体系由缓冲液、引物和探针、DNA模板和水组成，SYBR Green qPCR反应体系由缓冲液、引物、DNA模板、[（CH3）4N]Cl溶液和水组成。qPCR反应体系的构成见表2-7。

反应在CFX96 TouchTM型实时定量PCR仪（Bio-Rad，Hercules，California，U.S.A.）内进行，反应过程和结果采用软件Bio-Rad CFX Manager进行控制和分析。表2-8显示了各qCPR反应的程序。反应程序参考文献[162，168，175，190]。

2.标准曲线

在定量化分析各产甲烷菌种群、总细菌和古菌时，采用了各自模式菌株的质粒DNA作为标准品制作标准曲线，DNA标准品信息见表2-9。

对于共生乙酸氧化细菌，由于缺少模式菌株的DNA，因此只能进行相对定量分析，制作标准曲线所用的DNA模板为样品DNA。采用FTHFS-set和ACS-set引物进行PCR扩增，反应体系为50μL，包括：1×PCR缓冲液（5μL），0.75 U的Taq DNA聚合酶（0.6μL），0.2 mmol/L核苷酸（1μL），0.40μmol/L引物（各0.5μL），1.5 mmol/L MgCl2（3μL）。PCR程序为：94℃3 min，30个循环（94℃45 s，55℃1 min，72℃2 min），72℃延伸7 min。扩增产物纯化回收后，在紫外分光光度计下测试核酸浓度，即OD值。根据式（2-2）计算产物的拷贝数[191]。然后，依次以10n进行稀释，再进行qPCR扩增，扩增的反应体系见表2-9，反应程序参照表2-8。扩增得出梯度浓度样品的CT值，据此建立标准曲线。

表2-6 qPCR 扩增中的引物序列

续表

注：*核酸序列中，B代表C、G 或T；H 代表A、C 或T；M 代表A 或C；R 代表A 或G；W 代表A 或T；Y 代表T 或C。

表2-7 qPCR 反应溶液体系

(www.daowen.com)

表2-8 qPCR 扩增程序[162，168，175，190]

续表

表2-9 构建qPCR标准曲线的DNA标准品信息

3.DNA纯化

酚氯仿提取法获得的DNA需进行纯化。纯化方法如下：

（1）DNA收集，采用1.0%琼脂糖凝胶电泳（10 g/L琼脂糖，1×TAE）使DNA聚集，形成目的DNA片段。

（2）将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下（尽量切除多余部分），并放入1.5 mL离心管中。

（3）采用TIANgel Midi DNA纯化试剂盒（天根生化科技有限公司，北京，中国），按照说明对DNA进行纯化。

（4）采用紫外分光光度计（NanoDrop2000c，Thermo Scientific.，U.S.A.）检测回收得到的DNA溶液的浓度。