目前，进行蛋白质序列测定有两个关键步骤，即：①氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来。可采用化学法或酶法进行裂解。可以从蛋白质和多肽的N端进行裂解，也可以从C端进行分析。②正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。利用高效液相色谱，对带有生色基团的氨基酸残基进行分离分析。

（一）N端测序

1.N端测序原理　①蛋白质和多肽的自由α-氨基经与异硫氰酸苯酯（PITC）试剂耦联后，与其紧邻的第二个残基的键合力大大减弱，很容易断裂。②在无水条件下酸裂解，只切下与异硫氰酸苯酯（PITC）试剂耦联的残基。紧邻的第二个氨基酸残基暴露出自由的α-氨基，又可与PITC进行耦联反应。③噻唑呤酮苯氨—氨基酸（ATZ）ATZ—氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液（25％）中可转化成稳定的苯异硫尿氨基酸（PTH—氨基酸）。④可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及质谱等各种手段进行分析。近年来由于高效液相色谱技术具有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确等诸多优点，并且仪器自身结构也日臻完善，被广泛应用于PTH—氨基酸的鉴定。通常选用C-18反相柱进行分离。

2.N端测序前样品处理　①采用多种互补有效的手段鉴定样品的纯度，如SDS-PAGE、反相HPLC、毛细管电泳、阴离子或阳离子的FPLC等。②采用多种有效的脱盐方法如反相HPLC、凝胶过滤、透析、超滤等，但需注意在进行脱盐过程中除需考虑是否除盐完全外，所用试剂、仪器乃至操作规范也必须是测序级的，应尽量避免引入新的杂质。③疏基修饰。④去除N端封闭的基团。(www.daowen.com)

（二）C端测序

1.C端测序原理　基于与N端Edman降解类似的原理，C端分析采用化学试剂与蛋白质和多肽的α-羧基反应，反应后的C末端衍生物被切割下来，通过HPLC系统进行分离分析。一个完整的C端序列分析包括以下几个步骤：①蛋白质和多肽C端的自由羧基与乙酸酐反应生成混合酸酐，并进一步环化成嗯唑酮，而侧链上的羧基形成的混合酸酐难以成环。C端的嗯唑酮在硫氰四丁铵的作用下，转化为乙内酰硫脲（thiohydantoin，TH）。②侧链羧基形成混合酸酐后，与硫氰哌啶进一步作用形成酰胺，以保护侧链。③由于C端环化形成的TH衍生物较为稳定而不易被切割，因此产率不高。用溴甲基萘选择性地烷基化修饰硫原子，形成Alkylated-TH（ATH）衍生物，裂解产率将大大提高。④蛋白质和多肽中的羟基会干扰测序，因此需要修饰。在活化过程中，乙酸酐也会与羟基反应将其乙酰化，但反应不完全，在N—甲基咪唑（NML）和乙酸酐的共同作用下，Thr和Ser上的羟基基本被乙酰化。⑤C端的ATH衍生物在酸性条件下与［NCS］—反应而被裂解生成ATH—氨基酸，新的C端自动形成TH，而不必重新活化。因此，整个测序过程只需在开始时对C端进行一次性活化，并修饰Asp和Glu侧链羧基以及Thr和Ser的羟基。实际上，循环反应的只有烷基化和裂解两步。

2.C端测序样品前处理　①采用多种互补有效的手段鉴定样品的纯度，如：SDS-PAGE、反相HPLC、毛细管电泳、阴离子或阳离子的FPLC等。②采用蛋白A硅土凝胶过滤柱（Prosorb）装置，ProSorb的结构及使用方法与蛋白质纯化试剂盒（ProSpin）大致相同，不同的是用滤波器（filter）代替了ProSpin中的离心管，fliter可将样品中的小分子物质随水分一起吸收，以达到脱盐和浓缩样品的目的。③为了使Lys-ATH衍生物获得更好的分离效果，需先将蛋白质或多肽中Lys的ε-氨基与异氰酸苯酯（Phenylisocyanate，PhNCO）反应生成衍生物。