亚磷酸酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链合成的，DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5′→3′方向延伸。

（一）合成DNA的原理

1.脱保护基　将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-OH的保护基团DMT，获得游离的5′-OH。

2.活化　将质子化的核苷3′-亚磷酸酰胺单体与活化剂四氮唑混合，进入合成柱，形成亚磷酸酰胺四唑活性中间体，其5′端仍受DMT保护，3′端被活化与CPG载体上连接碱基的5′-OH发生缩合反应。

3.带帽（capping）反应　缩合反应中会有少量5′-OH没有参加反应，甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，使其不能再继续发生反应，这种短片段在纯化时可以分离去除。

4.氧化　缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酸酯键与连接在CPG上的寡糖核苷连接，而亚磷酸酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酸酰胺转化为磷酸三酯，得到稳定的寡糖核苷酸。

经过上述几个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连接到CPG的核苷酸上，再采取上述同样的步骤，即可得到一DNA片段样品。

（二）DNA的化学合成后处理

合成后的寡核苷酸链仍结合在固相载体上，且各种活泼基团也被保护基封闭着，最后要对其进行切割和脱保护基，随后进行纯化和定量。(www.daowen.com)

1.切割　合成的寡核苷酸链仍共价结合于固相载体上，用浓氨水可将其切割下来。切割后的寡核苷酸具有游离的3′-OH。

2.脱保护　切割后的寡核苷酸磷酸基及碱基上仍有一些保护基，这些保护基也必须完全脱去。磷酸基的保护基β-氰乙基在切割的同时即可脱掉，而碱基上的保护基苯甲酰基和异丁酰基需要在浓氨水中55℃放置15h左右方能脱掉。

3.纯化　纯化的目的主要是去掉短的寡核苷酸片段、盐及各种保护基等杂质。纯化常用方法有电泳法、高效液相色谱法（HPLC）和高效薄层色谱法等。

4.定量　Oligo DNA是以OD260值来计量的。在比色皿中，260nm波长下吸光度为1的1mL Oligo溶液定义为1 OD260，1 OD260 Oligo DNA的重量约等于33 μg，每个碱基的平均分子量约为330Da。因此合成的Oligo DNA摩尔数可按以下公式近似计算：摩尔数（μmol）=［OD值×33］/［碱基数×330］

5.溶解和保存　真空干燥的DNA，可以-20℃或室温条件下保存，使用时离心，加入足量的超纯水振荡溶解。

（三）寡核苷酸连接法

化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150～200bp，而绝大多基因的大小超过了这个范围，因此，需要将寡核苷酸适当连接组装成完整的基因。常用的基因组装方法主要有以下两种：①先将寡聚核苷酸激活，带上必要的5′-磷酸基团，然后与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有黏性末端的双链寡核苷酸片段，再用T4 DNA连接酶将它们彼此连接成一个完整的基团或基团的一个大片段。②将两条具有互补3′末端的长的寡核苷酸片段彼此退火，所产生的单链DNA作为模板在大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段作用下，合成出相应的互补链，所形成的双链DNA片段，可经过处理插到适当的载体上。