蛋白质组研究的第一步是制备蛋白质样品，这是最关键的一步。样品制备步骤主要包含四步，分别为：①破碎组织细胞；②沉淀蛋白；③纯化蛋白；④浓缩定量。通常可以用细胞或组织中的全蛋白组分进行蛋白质的分析，也可以进行样品分级，即采用各种方法将细胞或组织中的全蛋白分成几部分，分别进行蛋白质组的研究。样品主要根据蛋白质的溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行预分级，如专门分离出细胞核、核糖体、细菌细胞壁、叶绿体、线粒体等的蛋白质成分。样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行分析，通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。

（一）样品的类型

①整体样品；②组织样品；③细胞样品；④可溶性样品。

（二）样品制备基本原则

从蛋白质组大规模研究的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和物化特性多样等，要真正达到全息制备具有相当大的难度，在样品处理中必须遵循一定的原则，选择合理的方式方法。

样品处理主要原则如下：

①要避免蛋白质丢失，所以样品处理方法尽量简单。

②选择合适的细胞破碎法，以最小限度地减少蛋白质水解和降解。对于组分比较简单的样品，或者用于分析某一特定的细胞器，通常采用温和的裂解方法，例如渗透裂解、冻融裂解、裂解液裂、酶裂解等方法；难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，则采用剧烈的蛋白裂解法，例如超声裂解、压力杯、研磨法、机械匀浆、玻璃珠匀浆等方法。

③防止蛋白质水解，当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，其会导致某些蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此，使用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解，常用的抑制剂有苯甲基磺酰氟（PMSF）、4-（2-氨乙基）苯磺酰氟盐酸盐（AEBSF）、金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（EDTA）、肽蛋白酶抑制剂、乙二醇双四乙酸（EGTA）、苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）、亮抑酶肽（leupetin）、甲苯磺酰赖氨酸甲酮（TLCK）、甲苯磺酰等。

④新配制样品裂解液或分装冰冻储存，切勿使样品反复冻融。

⑤通过超速离心去除颗粒物，防止杂质堵塞凝胶孔隙。

⑥加入尿素后加温不要超过37℃，因提高温度能使尿素转化为异氰酸酯，它能对蛋白质进行修饰。

（三）样品中蛋白质沉淀

蛋白质沉淀可被用来浓缩样品，也能被用来将蛋白质从可能的干扰物中分离。主要的干扰物包括：盐离子、去污剂、核酸、脂类等。干扰物分离后，再将沉淀物溶在样品液中，某些蛋白在沉淀后并不容易重悬，因此，在样品制备中使用沉淀方法有可能改变样品蛋白的成分。常用的沉淀法有：盐析、三氯醋酸沉淀（TCA沉淀）、丙酮沉淀、在丙酮中用TCA沉淀等。

（四）干扰物质去除

样品中非蛋白质的不纯物质可能干扰蛋白质的分离及二维电泳图谱的质量，因此，在样品制备中需考虑清除这些杂质，这些杂质包括：样品制备过程中带来的盐、残留缓冲液和其他带电小分子、内源性的带电小分子（核苷、代谢物、磷脂等）、小离子分子、离子型去污剂、核酸、多聚糖、脂类及酚类化合物。

（五）实验操作举例

1.超声破碎法提取细胞蛋白质实验步骤

①取对数生长期的细胞，弃去培养液，PBS洗三次。

②加入PBS，用橡胶刮收集细胞，转入离心管中。(www.daowen.com)

③3000rpm/min，离心5min。

④弃上清，PBS洗3次（3000rpm/min，5min）。

⑤离心管中加入1mLPBS，重悬细胞，转入Eppendorf管中，3000rpm/min，离心5min。

⑥弃PBS，加入5倍体积的细胞裂解液，混匀，移入1.5mL的Eppendorf管，冰浴中以最大功率超声破碎细胞（3次×10s）。

⑦在15℃下，12000rpm/min，离心1h，取上清，用Bradford法进行蛋白质定量，分装，-80℃保存备用。

2.三氯醋酸/丙酮沉淀法提取组织蛋白实验步骤

①冰上取材，称湿重，置液氮中冻存或直接进行下一步。

②在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织。

③将粉末悬浮于含DTT（0.2％w/v）的10％三氯醋酸（w/v）的丙酮溶液中。

④-20℃下，蛋白沉淀过夜。

⑤4℃，12000rpm/min，离心30min。

⑥将沉淀重悬于含0.2％DTT的预冷丙酮中。

⑦-20℃放置1h。

⑧4℃，12000rpm/min，离心30min。

⑨在通风橱中让丙酮充分挥发，得到干燥的沉淀。

⑩用裂解液重新溶解沉淀，50-100mg组织加入裂解液1mL。

⑪15℃，12000rpm/min，离心1h。

⑫用Bradford法进行蛋白质定量，分装，-80℃保存备用。