（一）概述

目前，越来越多的生物体的全基因组测序陆续完成，但人类对于这些序列在生命活动中的意义和作用还知之甚少，这也促使基因组学的研究内容从序列结构的研究逐渐向基因功能的研究转变和扩展。功能基因组学（functional genomics），也称后基因组学（postgenomics），就是利用结构基因组学提供的信息和产物，对所有基因如何控制各种生命现象的问题作出回答。

结构基因组学通过基因作图、基因测序等手段，研究基因组遗传排列方式，以遗传标记、DNA序列的形式展现出来的遗传信息，成为功能基因组学研究的基础。功能基因组学是基因组分析的最新阶段，基本策略是将对基因和蛋白质的研究从单一对象研究扩展到以系统的方式对生物体内所有基因和蛋白质进行研究，利用结构基因组学所积累的DNA序列数据，应用大通量的实验分析方法，结合统计学和计算机技术，研究基因的表达、调控与功能，基因间、基因与蛋白质之间和蛋白质与底物、蛋白质与蛋白质之间的相互作用以及生物的生长、发育等规律。

（二）功能基因组学研究技术

1.突变基因检测技术　基因突变（gene mutation）是指基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，基因从原来的存在形式突然改变成另一种新的存在形式，替代了原基因并遗传给后代，这个新基因就叫做突变基因。

对基因突变的研究已成为现代医学研究的热点之一，可以分析由于基因突变产生的变异蛋白以及变异蛋白引起菌落形态、抗性等的改变来直接检测；也可以通过分析DNA构象或解链特性，或利用DNA变性和复性特性间接地来进行突变检测。间接方法是目前检测基因突变的主要方法。

（1）图位克隆：图位克隆（map-based cloning），又称定位克隆（positional cloning），由剑桥大学科尔森（Coulson）等提出。该技术不需要预先知道基因的DNA序列，根据目的基因在遗传图谱上的精细定位，构建含有目标基因的重叠群，获得含有目标基因的大片段克隆，再将这些克隆作为探针以同样的方式获得更多相互覆盖的亚克隆，对亚克隆进行测序，对测序结果进行分析来鉴别基因并获得功能信息。分析主要依靠检索NCBI、DDBJ和EMBL等数据库或根据基因的启动子、终止子、剪接位点、CpG岛等生物信息学的方法。

图位克隆的一般步骤是：①利用分子标记技术将目的基因在染色体上定位；②目的基因的精细定位和作图，这是图位克隆的限速步骤；③找到与目的基因两侧连锁最紧密的大片段克隆，以此为起点进行染色体步行，逐步接近目的基因；④用含有目的基因的大片段克隆去筛选cDNA文库，找出候选基因，对这些候选基因进行分析确定目的基因。

图位克隆需要构建完整的基因组文库，建立饱和的分子标记连锁图，所以对小基因组生物和已建立了高分辨率遗传图谱的生物的实际应用相对容易一些，但对基因组大、标记数目不多的生物效率低且投资大。理论上，图位克隆可以鉴定和克隆所有表型突变基因，模式生物基因组测序的完成，使图位克隆一个这些生物间的目的基因的时间大为缩短，该方法也发展成为分离目的基因的常规方法，不仅适用于单基因克隆，也适用于由多基因控制的数量性状的定位。

（2）单链构象多态性技术：单链构象多态性（Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP）技术是由Orita于1989年建立的，较早地应用于检测突变基因，操作简单，检出率80％～100％。

1）基本原理：DNA的空间构象由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持，当碱基发生变化时，其空间构象会或多或少地发生变化，在电泳时迁移率就会不同，因此，通过凝胶电泳就可将构象有差异的DNA分子分开。

2）操作流程：用特异引物PCR扩增待测基因片段；将PCR产物变性，接着快速复性，使之成为具有二级构象的单链DNA；将单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；分析电泳结果，由于正常基因和突变基因的迁移率不同，可以确定突变基因。

SSCP用于PCR扩增产物的基因突变，称为PCR-SSCP，检测灵敏度高，一个碱基的变化也可以检测出来。随后，基于RNA具有更为精细的二级和三级结构，其构象对单个碱基的变化很敏感，发展起来了RNA-SSCP技术。

（3）直接测序法：直接测序法（Direct Sequencing）不需要将PCR产物克隆到测序载体上，而是将扩增后的DNA片段直接进行测序分析，测序效率大大提升，可以对不同个体的同一基因进行测序分析，寻找序列中所有的碱基变异，理论上的检出率可达100％。

采用直接测序时，需先用不对称PCR的方法将扩增产物转化为单链测序模板，通常是通过引物浓度的差异来形成单链DNA，当一侧引物消耗尽后，别一侧引物扩增得到的片段即为单链DNA，可以用于测序。若将双脱氧终止法与PCR直接测序结合起来，用荧光标记的引物引导扩增，在反应体系中加入ddNTP，就可实现扩增与测序同时进行，而不需分离DNA单链。

直接测序法具有以下特点：①模板需要量少；②操作简单、方便、快速；③测序效率高、准确，但测序成本较高。

2.差异表达基因筛选　生物的生长发育受基因的精确调节，功能基因组学研究的主要内容之一是分析生物在不同发育时期、不同组织、不同生理状态下基因差异的表达状况，以研究生物生长、发育规律，为生命活动提供重要信息。差别杂交和微阵列分析两种方法均可以进行基因差异表达的筛选。

差别杂交（differential hybridization）又叫差别筛选（differential screening），首先分别获得目的基因表达存在差异的两种cDNA文库，一种目的基因正常表达，另一种目的基因不表达，然后分别用各自的总mRNA为探针去筛选两个文库，就可以找出差异表达的cDNA片段。在差异杂交技术的基础上，发展起来一系列新的方法，主要有差异显示、代表性差异分析、基因表达系列分析和抑制性扣除杂交等。

（1）差异显示技术：1992年，梁（Liang）和帕迪（Pardee）创立了差异显示技术（Differential Display，DD），它是在分子生物学当中最常用的逆转录反应（Reverse Transcription，RT），聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）及聚丙烯酰胺凝胶电泳这3种技术的基础上发展起来的。(www.daowen.com)

基本原理：利用RT、PCR、电泳来比较样品中基因表达的情况。大多数真核生物mRNA的3′端具有poly A尾，利用RT反应将含有poly T的引物锚定于poly A尾上，产生cDNA库。以反转录获得的cDNA为模板，利用锚定引物和上游随机引物对cDNA库进行PCR扩增，通过电泳获得差异表达基因扩增的条带，最后对差异条带进行回收、克隆、鉴定及分析。

DD的优势在于效率高，可以同时比较分析多个来源不同的样品，操作简单，重现性好，灵敏度高，低丰度的mRNA也可检测到，但其主要问题就是假阳性率高且影响因素多。

（2）代表性差异分析：1993年，在基因组消减杂交方法的基础上，由Wigler和Lisitsyn提出了一种基因克隆新策略——代表性差异分析（Representional Different Analysis，RDA）。RDA是基于PCR技术的从两个基因组中筛选差异序列的方法。

基本原理：消减杂交通过突变型（驱逐DNA）与野生型（检测DNA）基因组DNA的变性、复性等过程，使与驱逐DNA相同的大部分检测DNA通过与驱逐DNA完全复性而被去除，而检测DNA中特有的DNA片段因自身复性而被分离出来。RDA与消减杂交相比，它是用同一种限制性内切酶，将突变型和野生型的基因组DNA分别分解成短片段驱逐DNA和检测DNA，使因为链过长而不能扩增的基因组DNA减少了复杂性，由鉴定检测DNA和驱逐DNA之间序列的不同替代检测两个基因组DNA之间内切酶位点的不同，从而使分离那些因突变等原因造成的酶切位点改变的片段变得容易。

在RDA基础上加以改进应用于mRNA差异分析，即cDAN-RDA，双链cDNA经限制性内切酶消化后，产生平均大小为256bp的DNA片段，这样，绝大多数基因至少有两个酶切位点，是两端带有可识别和处理的末端片段，可以进行后续的扩增、消减、富集等操作。

虽然RDA具有灵敏度高、假阳性低等优点，但也存在一些问题，如每一种限制性内切酶酶切后的RDA只能使基因组DNA中的2％-15％得以分析和筛选，且操作繁琐、实验周期长、成本较高。

（3）基因表达系列分析：1999年，韦尔库列斯库（Velculescu）提出了用于基因表达模式分析的方法——基因表达系列分析（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE），不仅能在较短时间内检测细胞内几乎所有的mRNA，对这些mRNA的表达拷贝数进行定量分析，还可以发现潜在的未知基因。

其原理主要有3个方面：①来自转录子3′端特定位置的10～14bp的短标签（tag），充分含有识别转录本的信息；②连接多个短标签，形成大量多联体，克隆到生物载体内扩增，测序，得到代表转录本信息的标签序列；③将测序结果与已知的标签数据库进行分析，确定基因的表达丰度，代表转录体的表达水平等。

技术流程：①以细胞的总mRNA为模板，以生物素化的oligo-dT为引物，反转录合成cDNA；②用锚定酶（Anchoring Enzyme，AE，能特异识别4碱基酶切位点）酶切cDNA，酶切片段与链亲和素磁珠结合，收集寡聚dT与最近的酶切位点之间的片段；③将收集到的酶解片段分成两份，分别与连接子A、B连接（连接子为40bp核苷酸，含有特定型限制性内切酶酶切位点和PCR引物序列）；④用标签酶（Tagging Enzyme，TE，一种ⅡS型限制性内切酶，在识别位点下游10-14bp区域进行酶切）酶切cDNA与连接子结合的序列，释放带有连接子的标签；⑤将带有A、B连接子的标签用DNA连接酶连接，形成标签二聚体（也称双标记探针）；⑥对得到的标签二聚体进行PCR扩增并纯化PCR产物；⑦用锚定酶切除连接子A和B，将酶切片段连接形成长度在300-1000bp不等的串联体；⑧收集串联体并克隆、得到SAGE文库、测序；⑨通过软件对标签数据进行处理分析，生成相应的报告和丰度指标，比较SAGE文库标签的丰度并分析其意义。

SAGE以标签来代替转录体进行测序，不必对细胞内的每个转录体进行测序分析，大大提高了工作效率，是一项研究基因表达快捷、有效的技术，可以比较不同组织、不同时空条件下基因表达的差异性，具有灵敏性高、假阳性率低、可重复性强的优点，但因为标签确认因难，需要的样本量大，技术流程复杂、工作量大、成本高等原因，在基因组研究中并没有得到广泛应用。

（4）抑制性扣除杂交技术（SSH）：1996年，Diatchenco L等提出了以抑制PCR为基础的抑制性扣除杂交技术（Suppression Subtractive Hybridization，SSH），一种比较和分离不同细胞系、不同组织间或同一细胞系、同一组织在不同条件下有差别表达的基因的方法。

基本原理：所谓抑制PCR，是利用链内退火优于链间退火，比链间退火更稳定的特点，使非目的系列片段两端反向重复系列在退火时产生类似于“锅柄”的结构，无法与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。该方法运用了杂交二级动力学原理，即丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使原来在丰度上有差别的单链cDNA相对含量达到基本一致。

其基本过程是：①cDNA的合成：抽提两种不同细胞的mRNA分别作为检测样本（tester）和参照样本（driver），将它们反转录成cDNA。②酶切cDNA：将cDNA分别用四碱基识别酶（如Rca Ⅰ或Hae Ⅲ）酶切，以产生大小适当的平头末端cDNA片段。③接头连接：将tester cDNA分成均等的两份，各自接上两种接头。④扣除杂交：SSH需要进行两次扣除杂交，第一次是将连有接头的tester cDNA与过量的driver cDNA变性后退火杂交，杂交后有4种产物，单链tester cDNA、自身退火的tester cDNA双链、tester和diver的异源双链、driver cDNA，通过第一次杂交，实现了tester单链cDNA均等化（normalization），即使原来有丰度差别的单链cDNA的相对含量达到基本一致。第二次杂交是将第一次杂交产物混合，再加上新的变性driver单链，再次退火杂交，此时，只有第一次杂交后经均等化和扣除的单链tester cDNA和driver cDNA一起形成各种双链分子，这次杂交进一步富集了差异表达基因的cDNA，产生了一种新的杂交双链，新链两端有两个不同的接头，使其在以后的PCR中被有效地扩增。⑤PCR扩增：也要进行两次，第一次PCR，扣除杂交后的产物只有新的杂交双链才能以指数形式扩增，有效地扩增有差别表达的片段；第二次PCR，进一步扩增有差别表达的序列，增强其特异性扩增，以便于后续的筛选。⑥筛选与鉴定：将上述PCR产物转化细菌，经Xgal-IPTG显色反应，筛选出具有插入序列的克隆，含插入序列的形成白色的噬菌斑，否则形成蓝色的噬菌斑。再用Northern印记杂交技术找出具有差别表达的cDNA片段，最后进行测序。

SSH具有速度快、效率高、假阳性率低等优点，具有较高的特异性，为鉴别、分离新基因提供了一种强有力的手段。但SSH需要大量的mRNA，一般要几微克，若mRNA量不足，低丰度的差异表达cDNA可能检测不到，且SSH所研究的材料差异不宜过大。

（5）微阵列分析：微阵列（microarray assay）技术是近年来发展起来的一种分子生物学研究工具，1995年由斯凯纳（Schena）等进行了开创性的工作。根据微阵列上遗传信息的载体不同，有DNA微阵列、cDNA微阵列和蛋白质微阵列三种。

基本原理：首先利用光导化学合成、照相平版印刷以及固相表面化学合成等技术，将DNA片段（长度在几十到几百个碱基）固定在固相表面组成分子阵列，将来源不同的DNA或cDNA用放射性同位素或荧光物质进行标记作为探针，两者进行杂交，采用激光共聚焦显微镜对每个杂交点进行扫描，根据探针的位置和序列及杂交信号的强弱确定DNA的表达情况。

cDNA微阵列技术的主要优点是：灵敏度高，mRNA丰度低至十万分之一仍能被检测出；可使用几种不同颜色的荧光染料标记探针，这样进行一次杂交就可以同时分析不同细胞间基因表达的差异。但是，cDNA微阵列的主要不足是需要机器人点膜和特殊的信号检测分析系统，成本很高，点在玻璃片上的阵列不能重复使用。

DNA微阵列或DNA芯片几乎可用于所有核苷酸杂交技术的各个方面，而且可以同时比较成千上万个基因的表达状况，在DNA序列分析等方面具有相当大的优越性。