测序技术是基因组学研究的基础和核心技术，是对DNA分子的核苷酸排列顺序的测定。从20世纪70年代发明的双脱氧链终止法（又名Sanger测序法）到单分子实时测序，测序技术的发展经历了三代，第二代测序技术将生命科学研究带入到了基因组学时代，测序技术的不断进步促进了基因组学研究的发展。

（一）下一代测序技术

第二代和第三代测序技术统称为下一代测序技术（Next Generation Sequencing，NGS），主要特点就是高通量、实时、单分子测序，可以一次就完成几十万到几百万条DNA分子的测序。

第二代测序技术的典型代表是454测序技术平台的焦磷酸测序技术，其原理为经过一系列的反应，释放出荧光信号，根据捕捉到的荧光信号及其强度，读出相应的碱基及其数量。

第三代测序技术近年来发展最快、最热门、最有发展前景的技术之一是纳米孔测序技术，原理是不同的核苷酸空间构象不同，当它们一个接一个地通过纳米孔时，所引起的电流变化程度也不同，可以实现实时测序。

（二）基因组测序策略

虽然测序技术发展迅速，测序读长和通量有了很大的提高，但目前的技术水平还是不能对基因组直接进行测序，只能先将基因组分解，分别对分解后的小片段进行测序。目前基因组测序主要采用逐步克隆法（Clone by Clone）和全基因组鸟枪法（Whole Genome Shotgun）测序两种策略，且前者有向后者发展的趋势。

1.逐步克隆法　本方法在人类基因组计划中发挥了重要作用，它依赖于遗传图谱和物理图谱。首先将基因组分解成小片段，构建BAC文库，通过FISH或STS技术，将克隆在染色体上定位，依此对克隆进行排序，通过简单的组装工作完成全基因组测序。本方法的优点是准确、可靠，但由于构建遗传图谱和物理图谱非常困难，且耗时耗力，有明显的局限性。

2.全基因组鸟枪法　也称全基因组“霰弹”法测序，已逐渐成为基因组测序的主导策略，本方法不需要绘制物理图谱，而是将基因组DNA打成小片段，随机构建基因组文库，将这些小片段克隆到测序载体中进行测序，根据重叠区整合小片段，利用高性能计算机拼接出基因组DNA分子。全基因组鸟枪法的优点是经济、快速、高效，但对拼接方法和高性能计算设备要求非常高。

（三）全基因组测序

全基因组测序技术的出现对医学领域来说是一次革命性的进步，已经成为疾病研究、临床诊断中重要的手段。通过全基因组测序获得碱基全序列，便于进行全面、精确的分析，破解其包含的信息，加深对疾病发生机制的了解，有针对性地制定相应的应对办法，目前，主要应用于癌症、传染性疾病和遗传性疾病的致病机理的研究方面。(www.daowen.com)

全基因组测序的数据分析流程包括质量控制（Quality control）、比对（Mapping）、突变检测（Call variant）、突变注释（Annotation）四个方面。

（四）序列的组装

因为基因组测序是分段进行的，测序完成后需要将这些片段进行组装、拼接，最终获得完整的DNA序列，这是完成序列测定的关键步骤，组装主要依靠计算机软件来完成。

1.碱基读取　从测序仪上得到的并不是真正的核酸序列，而是荧光信号经处理后产生的带状图或峰图文件，这就需要将碱基识别出来，组成核酸序列，同时评估序列中的碱基可信度，这个识别过程叫做碱基读取（Base Calling）。

不使用荧光染料终止剂，经过四次反应，每次反应加入一种双脱氧核苷酸（ddNTP）作为链终止剂，得到的测序图是带状图；使用不同荧光标记的ddNTP作为终止剂，根据荧光区别四种碱基，经过一次反应便可完成测序，这样得到的是峰图文件。峰图文件是目前最常见的测序图。

对测序图的分析和解读依赖于相应的软件，如ABI公司的Sequencing Analysis和Sequence Scanner、Chromas、DNAstar等。1995年由Phil Green实验室开发的Phred软件碱基识别精度高、读长长且能给出每个碱基的质量评估值（用Phred Quality值来衡量，表征错误率的情况，值越高表明出错的可能性越低），它与组装软件Phrap相互配合，堪称是最完美的Base Calling软件。

2.拼接　序列拼接是根据原始的测序序列（read）还原原始序列的过程，一般包括组装（contig）、构建（scaffold）和补洞（gap）等几个步骤，

Contig是每个碱基都被准确定义的一段序列，组装基于read之间的重叠（overlap），将read两两比对，选择高分的两条read进行合并，重复这个过程，直到不能合并。顺序和方向都确定的一系列contig称为Scaffold，Scaffold的拼接主要依靠的是read之间的成对关系，但contig之间存在着未知缺口序列（gap），这可能是因为缺少测序序列的覆盖或由于重复序列导致的组装contig的过程被忽略而造成的，前者可以用两端已知的序列为引物按照基因组步移（Genome walking）的方法补洞，后者可以通过调用read的成对关系将gap序列补出。

用于序列拼接的主要软件是Phred-phrap-Consed系统，Phred（测序器）是一种碱基识别系统（base-caller），同时估计测序错误率，Phrap（组装器）根据Phred的结果，从头组装短序列；Phrap组装的序列由Consed（校对器）编辑、整合人工校对结果。

3.拼接过程中重复序列的影响　重复序列（repeats）对拼接的速度和精度影响很大，一方面引起拼接错误，另一方面也影响序列拼接的完整性，因此如何识别和处理重复序列成为拼接的最主要难题。处理的一般步骤是在拼接前将重复序列屏蔽掉，以提高序列拼接的精确度和降低错误率，拼接完成之后，将read再还原回去。