当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。对单层培养而言，80％汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。

1.贴壁培养的细胞传代

（1）用无菌的巴氏移液管吸尽原培养皿中的旧培养液以少量37℃，无Ca2+、Mg2+的HBSS洗单层贴壁细胞1或2次，以洗去抑制胰蛋白酶的胎牛血清。

（2）加足量的37℃胰蛋白酶/EDTA溶液，以覆盖住贴壁的细胞。

（3）培养皿置温盘上1～2min，轻轻叩击平皿底部使细胞游离，于倒置显微镜下观察细胞变圆，并从附着面脱离。

（4）加2mL的完全培养液，用移液管吸取细胞悬液吹打平皿底部2或3次，使底表面上残留的细胞脱落下来。一旦细胞呈单个分散状态，立即加入血清或含血清的培养液，进一步抑制胰酶的消化活性，因为它会对细胞产生损害作用。

（5）在每一个做了标记的新平皿或瓶中加入等体积的细胞悬液，或者用血细胞计数板计数细胞，调节细胞浓度约为5×104个/mL，然后将一定量的细胞接种到每一个培养皿或瓶中。

（6）每一瓶中补充4mL培养液，然后置于37℃，5％CO2加湿培养箱中孵育。(www.daowen.com)

（7）如有必要，3或4天后，去除旧培养液，添加37℃的新培养液至亚汇合的培养箱中。

（8）当细胞汇合后，重复1～7步骤，进行传代。

2.悬浮培养的细胞传代

（1）每2～3天后细胞生长密集，轻轻地将悬液培养的细胞从孵育箱中取出而不要摇动它，此时细胞沉降在瓶的底部。去掉1/3的旧液，加入等量的预热培养液。如果培养液体积小于15mL，轻轻摇动培养瓶使细胞悬浮，然后水平放入培养箱。

（2）在不需要更换培养液的培养期内，只需摇动培养瓶使细胞悬浮，观察培养液颜色的变化，它直接显示细胞生长代谢状况。

（3）当细胞生长到2.5×104个/mL时进行传代。从培养箱中取出培养瓶，摇动以重悬细胞。将一半的细胞悬液移入一个新培养瓶中，每瓶再补加预热的培养液7～10mL，然后放入培养箱。