理论教育 细胞生长和增殖过程在分子生物学技术中的应用

细胞生长和增殖过程在分子生物学技术中的应用

时间:2023-11-04 理论教育 版权反馈
【摘要】:传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞数量和细胞增殖速度等有关。连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增殖快,培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。初代培养细胞潜伏期长,约24~96小时或更长,连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短,仅6~24小时;细胞接种密度大时潜伏期短。pH和培养液血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响。

细胞生长和增殖过程在分子生物学技术中的应用

体内细胞生长在动态平衡环境中,而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其他容器,生存空间和营养是有限的。要经历如下几个时期。

(一)培养细胞生命期

是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。正常细胞培养时,不论细胞的种类和供体的年龄如何,在细胞全生存过程中,大致都经历以下三个阶段:

1.原代培养期 也称初代培养,即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段,一般持续1~4周。此期细胞呈活跃的移动,可见细胞分裂,但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的,也即各细胞的遗传性状互不相同,细胞相互依存性强。

2.传代期 初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系(Cell Line)。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好的情况下,细胞增殖旺盛,并能维持二倍体核型,称二倍体细胞系(Diploid Cell Line)。为保持二倍体细胞性质,细胞应在初代培养期或传代早期冻存。当前世界上常用细胞均在十代内冻存。如不冻存,则需反复传代以维持细胞的适宜密度,以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代10~50次左右,细胞增殖逐渐缓慢,以至完全停止,细胞进入第三期。

3.衰退期 此期细胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖;细胞形态轮廓增强,最后衰退凋亡。

(二)组织培养细胞一代生存期

所有体外培养细胞,包括初代培养及各种细胞系,当生长达到一定密度后,都需做传代处理。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞数量和细胞增殖速度等有关。接种细胞数量大、细胞基数大,相同增殖速度条件下,细胞数量增加与饱和速度相对要快。连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增殖快,培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。(www.daowen.com)

所谓细胞“一代”一词,系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间,这已成为培养工作中的一种习惯说法,它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞,即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代(Generation)或倍增〔Doubling〕不同;在细胞一代中,细胞能倍增3~6次。

细胞传一代后,一般要经过以下三个阶段:

1.潜伏期(Latent Phase) 细胞接种培养后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩,胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上,称贴壁,悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同,这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。初代培养细胞贴附慢,可有10~24小时或更多;连续细胞系和恶性细胞系快,10~30分钟即可贴附。

细胞贴附于支持物后,还要经过一个潜伏阶段,才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时,可有运动活动,基本无增殖,少见分裂相。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。初代培养细胞潜伏期长,约24~96小时或更长,连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短,仅6~24小时;细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时,标志细胞已进入指数增生期。

2.指数增生期(Logarithmic growth Phase) 这是细胞增殖最旺盛的阶段,细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数(Mitotic Index:MI)表示,即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数介于0.1%~0.5%,初代细胞分裂指数低,连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可有3%~5%。pH和培养液血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期,因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜的情况下,指数增生期持续3~5天后,随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少,最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后,如培养的是正常细胞,由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动,这种现象称接触抑制(Contact Inhibition)。而恶性细胞则无接触抑制现象,因此接触抑制可作为区别正常细胞与癌细胞的标志之一。肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖,导致细胞向三维空间扩展,使细胞发生堆积(Piled up)。细胞接触汇合成片后,虽发生接触抑制,只要营养充分,细胞仍然能够进行增殖分裂,因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大,培养液中营养成分减少,代谢产物增多时,细胞因营养的枯竭和代谢物的影响,则发生密度抑制(Density Inhibition),导致细胞分裂停止。因此细胞接触抑制和密度抑制是两个不同的概念,不应混淆。

3.停滞期(Stagnate Phase) 细胞数量达饱和密度后,细胞停止增殖,进入停滞期。此时细胞数量不再增加,故也称平顶期(Plateau)。停滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动,继而培养液中营养渐趋耗尽,代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代,否则细胞会中毒,发生形态改变,重则从底物脱落死亡,故传代应越早越好。传代过晚(已有中毒迹象)会影响下一代细胞的机能状态。

免责声明:以上内容源自网络,版权归原作者所有,如有侵犯您的原创版权请告知,我们将尽快删除相关内容。

我要反馈