人类携带的各种有害基因可以导致疾病的发生。要确认某一疾病的相关基因,必须进行基因定位(gene mapping)和结构分析。基因定位就是利用不同的方法将各种基因确定到染色体的实际位置上,并分析基因的结构和疾病状态下基因的突变。
(一)功能性克隆
功能克隆(functional cloning)是指从对一种致病基因的功能的理解出发克隆该致病基因。这种方法主要用于某些生物化学机理已经明确,基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病,实际上是利用纯化蛋白克隆致病基因。获得部分纯化的蛋白质后可以采用两种方式进行基因的克隆,一是根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作为探针,筛选cDNA文库,二是利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库。
(二)定位克隆
定位克隆(positional cloning)是指从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围,最后克隆该基因。实现从染色体定位到基因克隆是80年代医学分子生物学的重要进展之一。
系统的定位克隆工作包含遗传学分析和分子生物学分析两部分。遗传学分析方法包括交换分析和连锁不平衡分析以确定致病基因的染色体定位。分子生物学分析包括染色体异常(缺失、易位等)分析和基因文库的筛选与基因克隆。
(三)基因结构和产物功能的分析
如果采用上述策略克隆到一个已知基因,就可以利用对于该基因结构和功能的理解分析其与疾病的关系,确定是否有基因的突变,阐明突变产物的致病机制。(www.daowen.com)
如果获得的克隆是一个未知基因,则可进一步进行下列工作:
1.克隆和分析全长cDNA序列 根据cDNA序列推导出该基因编码的蛋白质的氨基酸序列;
2.克隆和基因组全序列分析 分析存在的内含子、启动子以及其调节位点,推论可能的基因表达调控方式;
3.确定基因在基因组中的位置和拷贝数 基因在染色体中的定位多采用染色体原位杂交法。由于目前人类基因组计划框架已经完成,因此可以直接从人类基因组数据库中确认其染色体定位。基因拷贝数可以用Southern杂交法确定,以已知拷贝数的质粒DNA或已知拷贝数的基因组DNA作为对照,根据放射性信号的强度可以计算出待测基因的拷贝数。
4.基因表达谱分析 要确定所克隆的基因的功能,应该确定该基因在不同组织和细胞中的表达状态。最经典和常用的方法是Northern分析,另外DNA点阵杂交也成为目前确定基因表达谱的首选方法,两者均检测的是mRNA的水平。
5.基因表达产物的功能分析 基因表达产物的功能研究是一个十分困难的课题,可以采用多种策略进行。包括:①找已知功能的同源蛋白或同源结构域,推论功能并用实验验证;②在细胞内表达该基因,观察其对细胞各种功能的影响;③利用反义核酸,RNA干涉,核酶在细胞水平抑制基因表达,从而分析细胞功能变化,建立基因剔除小鼠,分析该基因产物的功能;④分析与该基因产物相互作用的分子,或者是相互作用的蛋白分子或核酸。
在分子生物学技术不断发展的今天,鉴定与克隆疾病相关基因已经成为医学分子生物学的研究热点和重点,在对单基因决定的遗传性疾病有所认识的基础上,多基因遗传及环境与遗传相互作用所导致的疾病如糖尿病、高血压及肿瘤等亦逐步为人们所重视。这些研究将为认识疾病的发病机理提供极为重要的线索,为诊断和治疗带来革命性的变化。
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