重组体克隆的筛选与鉴定的原因：由体外重组产生的DNA分子，通过转化、转染、转导等适当途径引入宿主细胞会得到大量的重组体细胞或噬菌体。然而在这些重组体中，会有多种类型的DNA分子，其中包括：不带任何外源DNA插入片段，仅是由线性载体分子自身连接形成的环状DNA分子；由一个载体分子和一个或数个外源DNA片段构成的重组体DNA分子；单纯由数个外源DNA片段彼此连接形成的多聚DNA分子。无论采用何种方法导入重组载体，宿主都不可能百分之百地被转化或感染，必须将真正的转化体或转化细胞筛选出来。在重组DNA克隆设计开始时，就应设计出易于筛选重组子的方案。一个设计良好的方案往往可以事半功倍，节省许多人力物力。筛选方法的选择和设计主要依据载体、目的基因和宿主细菌不同的遗传学特性和分子生物学特性来进行。

DNA重组技术中常用的筛选和鉴定的方法可分为两大类：一类是利用宿主细胞遗传学表型的改变直接进行筛选；另一类是通过分析重组子的结构特征进行鉴定。前者常用抗药性、营养缺陷型显色反应和噬菌斑形成能力等遗传表型来筛选；后者常采用限制性内切酶酶切及电泳、探针杂交和核苷酸序列分析来鉴定目的基因的结构。此处介绍几种常用的鉴定含重组质粒细菌菌落的方法：遗传检测法；物理检测法；依赖于重组子结构特征分析的筛选法。

（一）遗传检测法

遗传检测法可分为根据载体表型特征和根据插入序列的表型特征选择重组子两种方法。

1.根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法

根据载体分子所提供的表型特征直接选择重组体DNA分子的遗传选择法是一种十分有效的方法，当它与微生物学技术相配合时便可用于大量群体的筛选。在基因工程中使用的所有的载体分子，都带有一个可选择的遗传标记或表型特征。质粒以及柯斯载体具有抗药性标记或营养标记，而对于噬菌体来说，噬菌斑的形成则是它们的自我选择特征。

面对由这种混合的DNA制剂转化而来的大量的克隆群体，需要采用特殊的方法才能筛选出可能含有目的基因的重组体克隆。

（1）抗生素筛选：大多数克隆载体带有抗生素抗性基因，如抗四环素基因（tetR）、抗氨苄青霉素基因（ampR）等。理论上，只有含有这些重组子的转化细胞才能够在含有相应抗生素的琼脂平皿上生长成菌落。例如质粒载体含有一种或两种抗生素的耐药基因，当把这种质粒转入大肠杆菌后，此菌便获得了抵抗这种抗生素的能力。目前分子克隆所用的克隆载体多含氨苄青霉素的耐药基因，所以涉及最多的是氨苄青霉素筛选。当将氨苄青霉素加入培养基中后，只有含质粒的细菌能够生存，而不含质粒的细菌则死亡（见图5-21）。但是实际上，自身环化的载体、未酶切完全的载体或非目的基因插入载体形成的重组子也能转化细胞形成假阳性菌落。

（2）营养缺陷型的互补筛选法：营养缺陷型的互补筛选法包括插入互补和插入失活两种。

插入互补是指由于外源基因的插入弥补了宿主菌原来的基因缺陷性状。如把酵母基因组DNA随机切割后插入到大肠杆菌的ColE1质粒中，然后将重组质粒转化到大肠杆菌his（组氨酸）突变菌株细胞中，凡含有酵母his基因并获得表达的转化菌就能在不含his营养成分的培养基中生长。

图5-21　抗生素筛选带有重组载体的克隆

插入失活是指由于外源基因的插入，使重组子丧失了原来具有的某些特征，如不能合成某种产物，当这种改变有明显的表型变化时，就可以用于鉴别重组子。这里以蓝-白斑筛选法为例加以说明。使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。pUCl8/19以及其他一些载体中含有β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列及其氨基端146个氨基酸的α-肽编码区，尽管它的MCS也位于其中，但由于巧妙的读框设计仍使其保留了α-肽的功能。如果用这一类质粒转化β-半乳糖苷酶基因缺失突变菌（gal-），由于质粒表达的α-肽可以补充菌株缺失的α-肽，使其产生有活性的β-半乳糖苷酶分解半乳糖。在加入了β-半乳糖苷酶基因表达诱导剂IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）和β-半乳糖苷酶底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的培养基上生长的菌落呈现蓝色。这种现象被称为α-互补效应。外源DNA片段克隆到上述的这个区段后，使LacZ基因失活，不再产生α-肽，也不再产生有活性的β-半乳糖苷酶。在加入IPTG和X-gal的平板上不再出现蓝色菌落，而是白色菌落（见图5-22）。这是鉴别质粒载体内有无插入片段的所谓蓝白筛选方法的原理。

通过上述技术手段只能让我们知道所得的质粒或噬菌体等的DNA具有重组子的特征，至于目的片段的序列则必须经过DNA序列测定予以证实。

2.根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法　重组DNA分子转化到大肠杆菌宿主细胞之后，如果插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能的表达，那么分离带有此种基因的克隆，最简便的途径便是根据表型特征的直接选择法。其基本原理是，转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的宿主细胞表现出外源基因编码的表型特征。(www.daowen.com)

（二）物理检测法

常用的重组体分子的物理检测法有凝胶电泳检测法和R-环检测法两种。

1.凝胶电泳检测法　带有插入片段的重组体在相对分子质量上会有所增加。分离质粒DNA并测定其分子长度是一种直截了当的方法。电泳法筛选比抗药性插入失活平板筛选更进了一步。有些假阳性转化菌落，如自我连接载体、缺失连接载体、未消化载体、两个相互连接的载体以及两个外源片段插入的载体等转化的菌落，用平板筛选法不能鉴别，但可以被电泳法淘汰。

2.R-环检测　R-环是指RNA通过取代与其序列一致的DNA链而与双链DNA杂交，被取代的DNA单链与RNA-DNA杂交双链所形成的环状结构。在临近双链DNA变性温度下和高浓度（70％）的甲酰胺溶液中，即所谓的形成R-环的条件下，双链的DNA-RNA分子要比双链的DNADNA分子更为稳定。因此，将RNA及DNA的混合物置于这种退火条件下，RNA便会同双链DNA分子中的互补序列退火形成稳定的DNA-RNA杂交分子，而被取代的另一条链处于单链状态。

图5-22　蓝-白斑筛选

这种由单链DNA分子和双链DNA-RNA分子形成的“泡状”体，即所谓的R-环结构。R-环结构一旦形成就十分稳定，而且可以在电子显微镜下观察到。所以，应用R-环检测法可以鉴定出双链DNA中存在的与特定RNA分子同源的区域。

（三）依赖于重组子结构特征分析的筛选法

1.限制性核酸内切酶酶解分析法　从转化菌落中初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性核酸内切酶（一种或两种）酶解、切割重组子释放出的插入片段，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片段和载体的大小，确定是否含有外源基因插入及其插入方向等。

2.Southern印迹杂交筛选　为确定DNA插入片段的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片段作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片段是否是所需的靶基因片段。Southern印迹转移技术详见第四章。

3.利用PCR方法筛选确定重组子　用PCR技术对重组子进行分析，不但可以迅速扩增插入片段，而且可以直接进行DNA序列分析。因为对于表达型重组子，其插入片段的序列的正确性是非常关键的。PCR法既适用于筛选含特异目的基因的重组克隆，也适用于从文库中筛选含感兴趣的基因或未知的功能基因的重组克隆。前者采用特异目的基因的引物，后者采用载体上的通用引物。

4.菌落（或噬菌斑）原位杂交　菌落或噬菌斑原位杂交技术是将转化菌DNA转移到硝酸纤维膜上，用放射性同位素或非放射性标记的特异DNA或RNA探针进行分子杂交，然后挑选阳性克隆（见图5-23）。这种方法能进行大规模操作，是筛选基因文库的首选方法。

图5-23　菌落或噬菌斑原位杂交筛选重组体