质粒是一种相对分子质量较小、独立存在于细菌染色体外的、具有自主复制能力的环状双链DNA分子。分子量小的为2000～3000个碱基对，大的可达数千个碱基对，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入宿主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”，二是“松弛型”。质粒常用松弛型，复制快、拷贝数多，质粒分子能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，能在宿主细胞内独立自主地进行复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制，并在细胞分裂时恒定地传给子代细胞。质粒往往带有某些特殊的不同于宿主细胞的遗传信息，所以质粒在细菌内的存在会赋予宿主细胞一些新的遗传性状，如对某些抗菌素或重金属产生抗性等。根据宿主菌的表型可识别质粒的存在，这一性质被用于筛选和鉴定转化细菌。

质粒载体通常是以细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工构建质粒。质粒载体一般只能接受小于15 kb的外源DNA插入片段。插入片段过大，会导致重组载体扩增速度减慢，甚至使插入片段丢失。常用的质粒载体有pBR322、pUC和pGEM系列等多种。质粒载体不仅用于转化细菌，也可以用于转化酵母、哺乳动物细胞和昆虫细胞等。质粒载体可以用于目的基因的克隆和表达。

（一）pBR322质粒载体

pBR322质粒载体是目前在基因克隆中广泛使用的一种大肠杆菌质粒载体，是由人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。质粒载体符号pBR322中的“p”代表质粒；“BR”代表两位研究者姓氏的字首，“322”是实验编号。它是由pSF2124、pMB1及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。

质粒载体pBR322是研究得最多，使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。pBR322是由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于pBR322质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ampr）；第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；第三部分则来源于派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori），具有如下优点：

①pBR322质粒载体的大小为4361bp，相对分子质量较小。

②它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。

③具有两种抗生素抗性基因——氨苄青霉素（amp）和四环素（tet）抗性基因，可供作转化子的选择标记。pBR322 DNA分子内具有多个限制酶识别位点，外源DNA插入某些位点会导致抗菌素抗性基因失活，利用质粒DNA编码的抗菌素抗性基因的插入失活效应，可以有效地检测重组体质粒。同时，由于其为人工构建质粒，虽然带有抗药性基因，但已不能在自然界的宿主细胞间转移，同时应用安全菌株，亦不会引起抗生素抗性基因传播。

④在细菌中的分子个数高，即具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000～3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。

在pBR322质粒载体的构建过程中的一个重要目标是缩小基因组的体积，移去一些对基因克隆载体无关紧要的DNA片段、限制酶识别位点，同时还要设法使质粒同存在的任何易位子统统失去功能。易位子的转移（即易位）有可能导致选择标记的丧失，甚至也有可能使克隆的DNA片段丧失或重排。构建pBR322质粒还必须通过体内易位或体外重组加入可选择的抗药性标记。图5-6表示了质粒载体的形体结构。

图5-6　pBR322质粒载体结构

（二）pUC质粒载体

pUC质粒载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5′-端带有一段多克隆位点的lacZ基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。一种典型的pUC系列的质粒载体，包括如下四个组成部分：①来自pBR322质粒的复制起点（ori）；②氨苄青霉素抗性基因（ampr），但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点；③大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ基因；④位于lacZ基因中的靠近5′-端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能。

pUC质粒载体有着明显的优点：①具有更小的分子量和更高的拷贝数，如pUC8为2750bP，pUC18为2686bP。pUC8质粒平均每个细胞即可达500～700个拷贝。②适用于组织化学方法检测重组体，pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。因此，在应用pUC8质粒为载体的重组实验中，可用Xgal显色的组织化学方法一步实现对重组体转化子克隆的鉴定。③具有多克隆位点MCS区段，pUC8质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点MCS区段，它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。因此，克隆在MCS当中的外源DNA片段，可以方便地从pUC8质粒载体转移到M13mp8噬菌体载体上，进行克隆序列的核酸测序工作。同时，也正是由于具有MCS序列，可以使具有两种不同黏性末端（如EcoR I和BamH I）的外源DNA片段，无需借助其他操作而直接克隆到pUC8质粒载体上。

pUC18和pUC19大小只有2686bp，是最常用的质粒载体，其结构组成紧凑，几乎不含多余的DNA片段（图5-7）。由pBR322改造而来，其中lacZ基因来自M13mp18/19噬菌体载体。这两个质粒的结构几乎是完全一样的，只是多克隆位点的排列方向相反。这些质粒缺乏控制拷贝数的rop基因，因此其拷贝数达500～700。pUC18、pUC19载体适合于DNA片段的克隆、进行DNA测序、对外源基因进行表达等（图5-7）。pUC系列载体含有一段lacZ蛋白氨基末端的部分编码序列，在特定的受体细胞中可表现α-互补作用。因此在多克隆位点中插入了外源片段后，可通过α-互补作用形成蓝色和白色菌落筛选重组质粒，以判断载体中有无DNA片段的插入。同时还可以通过载体上的lac promoter表达外源基因，对插入载体中的DNA片段进行测序等。

图5-7　pUC18质粒载体图谱

（三）pGEM-3Z/4Z质粒载体

pGEM-3Z/4Z由pUC18/19增加了一些功能片段改造而来，大小为2.74kb。与pUC18/19相比，在多克隆位点的两端添加了噬菌体的转录启动子，如Sp6和T7噬菌体的启动子。pGEM-3Z和pGEM-4Z的差别在于二者互换了两个启动子的位置。

（四）多功能质粒载体

在上述载体的基础上，人们设计出一些多功能的质粒载体，这类质粒载体综合了以上质粒的特点。除了作为质粒载体的基本要素外，综合了上述功能要素，如多克隆位点、α-互补、噬菌体启动子和单链噬菌体的复制与包装信号。这类质粒典型的有pBluescriptⅡKS（±），这类质粒一般由4个质粒组成一套系统，其差别在于多克隆位点方向相反（根据多克隆位点两端KpnⅠ和SacⅠ的顺序，用KS或SK表示），或单链噬菌体的复制启始方向相反（或者说，引导DNA双链中不同链合成单链DNA，用+或-表示）。pBluescriptⅡKS（±）的多克隆位点与pUC18/19的不同，且使用f1噬菌体的复制与包装信号序列。

（五）质粒提取

1.提纯质粒DNA　已经有许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：细菌培养物的生长、细菌的收获和裂解、质粒DNA的纯化。

（1）细菌培养物的生长：从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中（在含有相当量的抗生素的液体培养基中生长），然后从中纯化质粒。现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，只要将培养物放在标准LB培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。然而，较长一代的载体（如pBR322）由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。这样，像pBR322一类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量截然不同，前者大为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素已成为标准的操作，用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务都能够完成。

（2）细菌的收获和裂解：细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于3个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。

①大质粒（大于15kb）容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进行处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。

②可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。

③一些大肠杆菌菌株（如HB101的一些变种衍生株）用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，随后用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带，因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。故从诸如HB101和TG1等大肠杆菌菌株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。

④当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株（如HB101）中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温浴（如用限制酶消化）时，质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤（用酚-氯仿进行抽提）可以避免此问题。

⑤目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以至于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占的体积。大量高度黏稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。

（3）质粒DNA的纯化：含有目的基因的DNA片段，即便进入到宿主细胞内，仍然是不能进行增殖的。它必须与适当的能够自我复制的DNA分子，例如质粒、噬菌体或病毒分子等结合之后，才能够通过转化或其他途径导入寄主细胞，并像正常的质粒或病毒一样增殖和易于检测。

常使用的所有质粒DNA的纯化方法都利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如，用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和（每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子）。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分子在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯中的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。分离质粒载体的DNA有许多种不同的方法，其共同的步骤是先用溶菌酶处理含有质粒载体的寄主菌培养物，以除去它们的细胞壁，然后再加入SDS之类的去污剂，使之发生温和的溶菌作用。于是质粒DNA、多聚核糖体、可溶性蛋白质、tRNA等细胞内的大分子物质便逐步地释放出来，而核染色体的DNA则仍然附着在细胞的残渣碎片上，需经过离心处理才能使它们同质粒DNA分开。将离心所得的含有质粒DNA的上清液，加酚处理脱去蛋白，剩下DNA混合物，然后用乙醇沉淀就可以得到质粒DNA。下面介绍一种具体方法。

1）聚乙二醇沉淀法提取质粒DNA

①将核酸溶液所得转入15mL Corex管中，再加3mL用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，于4℃下以10 000转/分离心10min。LiCl可沉淀高分子RNA。

②将上清转移到另一个30mL Corex管内，加等量的异丙醇，充分混匀，于室温以10 000转/分离心10min，回收沉淀的核酸。

③小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70％乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管倒置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。

④用500μL含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/mL）的TE（pH8.0）溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30min。

⑤加500μL含13％聚乙二醇的1.6mol/L NaCl，充分混合，用微量离心机于4℃以12000转/分离心5min，以回收质粒DNA。

⑥吸出上清，用400μL TE（pH8.0）溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚-氯仿、氯仿各抽提1次。

⑦将水相转到另一微量离心管中，加100μL 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加2倍体积（约1mL）乙醇，于室温放置10min，于4℃以12 000转/分离心5min，以回收沉淀的质粒DNA。

⑧吸去上清，加200μL处于4℃以12 000转/分离心2min。

⑨吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。

⑩用500μL TE（pH8.0）溶解沉淀后测量OD 260，计算质粒DNA的浓度，然后将DNA贮于-20℃。

2.质粒DNA的小量制备　质粒DNA的小量制备可采用下述的碱裂解法或煮沸法。

（1）细菌的收获和裂解

1）细菌的收获：

①将2mL含相应抗生素的LB加入到容量为15mL并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。

②将1.5mL培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000转/分离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。(www.daowen.com)

③吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。

2）碱裂解：

①将细菌沉淀所得重悬于100μL用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡。溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；10mmol/LEDTA（pH8.0）。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶约100mL，在6.895×104Pa高压下蒸汽灭菌15min，贮存于4℃。须确使细菌沉淀在溶液Ⅰ中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。

②加200μL新配制的溶液Ⅱ。溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）；1％SDS。盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。

③加150μL用冰预冷的溶液Ⅲ。溶液Ⅲ：5mol/L乙酸钾60mL；冰乙酸11.5mL；水28.5mL。盖紧管口，将管倒置后和振荡10秒钟的溶液Ⅲ在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3～5min。

④用微量离心机于4℃12000转/分离心5分钟，将上清转移到另一离心管中。

⑤可做可不做：加等量酚-氯仿，振荡混匀，用微量离心机于4℃以12000转/分离心2min，将上清转移到另一离心管中。有些工作者认为不必用酚-氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。

⑥用2倍体积的乙醇于室温沉淀双链DNA。振荡混合，于室温放置2min。

⑦用微量离心机于4℃以12 000转/分离心5min。

⑧小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。

⑨用1mL 70％乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀后，再按步骤⑧所述方法去掉上清，在空气中将核酸沉淀干燥10min。

此法制备的高拷贝数质粒（如pUC），其产量一般约为：每毫升原细菌培养物3～5μg。如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1μL DNA溶液加到另一含8μL水的微量离心管内，加1μL 10×限制酶缓冲液和1单位所需限制酶，在适宜条件温浴1～2h。将剩余的DNA贮存于-20℃。此方法按适当比例放大可适用于100mL细菌培养物。

3）煮沸裂解：

①将细菌沉淀，所得重悬于350μL STET中。STET：0.1mol/L NaCL；10mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；1mmol/L EDTA（pH8.0）；5％Triton X-100。

②加25μL新配制的溶菌酶溶液（10mg/mL），用10mmol/L Tris-HCl（pH8.0）配制，振荡3秒钟以混匀。如果溶液中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。

③将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为40秒。

④用微量离心机于室温以12 000转/分离心10min。

⑤用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。

⑥在上清中加入40μL 5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420μL异丙醇，振荡混匀，于室温放置5min。

⑦用微量离心机于4℃以12 000转/分离心5分钟，回收核酸沉淀。

⑧小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。

⑨加1mL 70％乙醇，于4℃以12 000转/分离心2min。

⑩按步骤⑧所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体。

⑪用50μL含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/mL）的TE（pH8.0）溶解核酸稍加振荡，贮存于-20℃。

当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株（如HB101）中小量制备DNA时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A，以后在Mg2+存在下温浴时质粒DNA可被降解。在上述方案的步骤⑨之间增加一步，即用酚-氯仿进行抽提，可以避免这一问题。

（2）质粒DNA小量制备的问题与对策

裂解和煮沸法都极其可靠，重复性也很好，而且一般没有多么麻烦。多年来，在我们使用这两种方法的过程中，只碰到过两个问题：

①有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚-氯仿对溶液进行抽提可以去除小量制备物中的杂质。如果依然存在，可用离心柱层析纯化DNA。

②在十分偶然的情况下，个别制备物会出现无质粒DNA的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。

3.质粒DNA的大量制备

（1）在丰富培养基中扩增质粒：许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每500mL培养物2～5mg质粒DNA，而且重复性也很好。

①将30mL含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期。培养基中应含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体物进行接种。

②将含相应抗生素的500mL LB或肉汤培养基（预加温至37℃）放入25mL对数晚期的培养物，于37℃剧烈振摇培养25h（摇床转速300转/分），所得培养物的OD600值约为0.4。

③可做可不做：加2.5mL氯霉素溶液（34mg/mL溶于乙醇），使终浓度为170μg/mL。像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝数扩增的质粒，有必要进行扩增。一些质粒（如pUC质粒）可复制达到很高的拷贝数，因此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和，即可从细菌培养物中大量提纯。但用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可缩小细菌裂解物的体积和降低黏稠度，极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细菌培养物里加入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。

④于37℃剧烈振摇（300转/分），继续培养12～16h。

（2）细菌的收获和裂解

1）收获：①于4℃以4000转/分离心15min，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。②将细菌沉淀重悬于100mL用冰预冷的STE中。STE：0.1mol/L NaCl；10mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；1mmol/L EDTA（pH8.0）。按步骤①所述方法离心，以收集细菌细胞。

2）碱裂解：

①将洗过的500mL培养物的细菌沉淀物重悬于10mL溶液I（如前述）中。

②加1mL新配制的溶菌酶溶液（如前述）。当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。

③加20mL（40mL）新配制的溶液Ⅱ（如前述）。盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5～10min。

④加15mL（20mL）用冰预冷的溶液Ⅲ（如前述）。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10min，应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染色体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合物。

⑤于4℃以4000转/分离心15min。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20min，然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的黏稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分。

⑥上清过滤至一个250mL离心瓶中，加0.6倍体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10min。

⑦于室温以500转/分离心15min，回收核酸。

⑧小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70％乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相连的一次性使用的吸头吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。

⑨用3mL TE（pH8.0）溶解核酸沉淀。

⑩纯化。