DNA连接酶（DNA Ligase）是基因工程的重要工具酶之一，主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用。基因工程中，大肠杆菌DNA连接酶只连接黏性末端，而噬菌体T4 DNA连接酶既可连接黏性末端，又可连接平末端。

大肠杆菌DNA连接酶最初是在大肠杆菌细胞中发现的，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色。它是一种封闭DNA链上的缺口酶，借助ATP水解提供的能量催化DNA链的3′-羟基末端和5′-磷酸末端形成3′，5′磷酸二酯键，把两个DNA片段连接成一个片段。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的（T4DNA连接酶除外），而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。大肠杆菌DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。(www.daowen.com)

在基因工程技术中最常使用的是噬菌体T4 DNA连接酶。T4 DNA连接酶分子是一条多肽链，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。T4 DNA连接酶是ATP依赖的DNA连接酶，催化两条DNA双链上相邻的5′-磷酸基和3′-羟基之间形成磷酸二酯键。它的连接效率高，可连接DNADNA，DNA-RNA，RNA-RNA，既可连接双链DNA的平末端，也可用于连接相容黏末端及其中的单链切口。另外，NH4Cl可以提高大肠杆菌DNA连接酶的催化速率，而对T4 DNA连接酶则无效。无论是T4 DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。