DNA聚合酶（DNA polymerase）催化DNA合成的反应，在重组DNA技术中用于DNA的体外合成。经常使用的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段（Klenow酶）、T4 DNA聚合酶以及耐高温DNA聚合酶等。这些DNA聚合酶的共同特点在于，它们都能够把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3′-羟基末端上。

图5-4　大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

（一）大肠杆菌DNA聚合酶I

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（DNApolymeraseⅠ，DNApolⅠ）是1958年首先在大肠杆菌中发现的，称DNA聚合酶I。纯化的DNApolⅠ由一条多肽链组成，约含1000个氨基酸残基，分子量约为109KD（图5-4）。

DNA聚合酶I在空间结构上近似球体，在酶分子上有一个深沟（cleft），带有正电荷，这是该酶的活性中心位置，在此位置上至少有6个结合位点：①模板DNA结合位点；②DNA生长链或引物结合位点；③引物末端结合位点，用以结合专一引物或DNA生长链的3′-OH；④脱氧核苷三磷酸结合位点；⑤5′→3′外切酶活性位点，用以结合生长链前方的5′-端脱氧核苷酸并切除之；⑥3′→5′外切酶活性位点，用以结合和切除生长链上未配对的3′-端核苷酸。

DNA聚合酶I具有多种催化功能：①5′→3′聚合作用，沿着引物3′-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令逐个将核苷酸加上去；②3′→5′外切酶活性，起校对作用；③5′→3′外切酶活性，切除修复作用。在重组DNA技术中DNA聚合酶Ⅰ的主要作用是通过切口平移的方式制备用于核酸分子杂交分析用的DNA探针。

（二）Klenow酶

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段，小片段的分子量为34KD，大片段分子量为76KD，通常将大片段称为Klenow片段或Klenow酶。此酶的模板专一性和底物专一性均较差，它可以用人工合成的RNA作为模板，也可以用核苷酸为底物。在无模板和引物时还可以从头合成同聚物或异聚物。

Klenow酶保留了DNA聚合酶I的5′→3′聚合活性和3′→5′核酸外切酶活性两种功能，缺少5′→3′核酸外切酶活性的功能。Klenow酶能按模板碱基序列合成DNA，是分子生物学常用的工具酶。在重组DNA技术中Klenow酶的主要作用是对5′突出末端或3′突出黏末端都可以催化产生平末端，用于后续的平端连接，也可以用于5′突出末端的标记；随机引物法进行DNA标记；Sanger双脱氧法进行DNA测序；cDNA第二链的合成或定点突变反应第二链的合成。(www.daowen.com)

（三）T4 DNA聚合酶

T4 DNA聚合酶（T4DNAPolymerase）与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段相似，也是一条多肽链，分子量亦相近，但氨基酸组成不同。T4 DNA聚合酶也是一种模板依赖的DNA聚合酶，可以结合在有引物的单链DNA模板上，从5′→3′方向催化DNA合成反应。T4 DNA聚合酶具有3′→5′外切酶活性，但不具有5′→3′外切酶活性。

T4 DNA聚合酶由于同时具有5′→3′DNA聚合酶活性和3′→5′外切酶活性，可以用于将5′端突出末端补平或3′端突出末端削平。T4 DNA聚合酶的3′→5′DNA外切酶活性对于单链DNA要比双链DNA活性更高，即单链DNA要比双链DNA中的非配对链部分更容易被T4 DNA聚合酶所消化。

T4 DNA聚合酶还可通过置换反应进行标记DNA探针合成；在定点突变过程中进行第二链的合成；不依赖于连接反应的PCR产物克隆；利用大肠杆菌Klenow大片段聚合酶5′→3′聚合酶活性和T4 DNA聚合酶3′→5′外切酶特性构建植物高效表达载体pBLT35Svp4-ST。

（四）Taq DNA聚合酶

Taq DNA聚合酶是从一种水生栖嗜热杆菌（Thermus aquaticus）中分离提取出来的，是已发现的耐热DNA聚合酶中活性最高的一种，达200，000单位/mg。Taq DNA聚合酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，这在需要高温环境的PCR反应中有着重要意义。Taq DNA聚合酶在97.5℃时的半衰期为9min。它的最适温度为75～80℃，72℃时能在10秒内复制一段1000bp的DNA片段。这种较高的酶活性有明显的温度依赖性。低温下，Taq DNA聚合酶表现活性明显降低，90℃以上时合成DNA的能力有限。因此Taq DNA聚合酶取代了之前常用于PCR反应的大肠杆菌中的DNA聚合酶。PCR反应中应用Taq DNA聚合酶，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷，大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

Taq DNA聚合酶具有5′→3′外切酶活性，但不具有3′→5′外切酶活性，因而在DNA合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能，保真性相对较低，出错率大约为1×10-5/bp。

Taq DNA聚合酶还具有非模板依赖性活性，可将PCR双链产物的每一条链3′端加入单核苷酸尾，故可使PCR产物具有3′突出的单A核苷酸尾；另一方面，在仅有dTTP存在时，它可将平端的质粒的3′端加入单T核苷酸尾，产生3′端突出的单T核苷酸尾。应用这一特性，可实现PCR产物的T-A克隆法。