（一）限制性核酸内切酶概述

限制性核酸内切酶是能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶，简称为限制性内切酶。限制性内切酶天然存在于细菌体内，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰体系，以限制外源DNA和保护自身DNA，对细菌性状的稳定遗传具有重要意义。

根据裂解DNA的方式等方面的差异，通常将限制性核酸内切酶分为三类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类。基因工程中常用Ⅱ型，Ⅱ型限制性核酸内切酶可对DNA进行可控制的精确切割。限制性核酸内切酶命名原则，以Hin dⅢ为例：①第一个字母为细菌属的词首字母，斜体大写；②第二、第三个字母是细菌种的词首字母，斜体小写；③第四个字母（有时无）代表获得该酶的特定菌株，大写或小写；④用罗马数字表示发现的先后次序（见图5-3）。

图5-3　限制性核酸内切酶命名原则

（二）限制性核酸内切酶的切割位点及结果

重组DNA技术中常用的Ⅱ型限制性内切酶可以识别特异的核苷酸序列，通常为4、6、8个碱基对。这些序列中，许多属于回文结构（palindrome），即同一条单链以中心轴对折可形成互补的双链，也就是说序列中两条链按5→3方向的碱基序列完全一致。限制性内切酶在识别位点或其周围切割双链DNA，切割后产生的片段具有不同的末端。如形成没有单链突出的末端，称为平端或钝端（blunt end），如Sma I的切割作用；如形成有单链突出的称为黏性末端（cohesive end）。黏性末端中有5′突出的黏性末端，如BamH I的切割作用；也有3′突出的黏性末端，如Pst I的切割作用。

(www.daowen.com)

有些限制性核酸内切酶虽然识别的序列不完全相同，但切割DNA后可以产生相同的黏性末端，称为配伍末端（compatible end），切割产生配伍末端的两个酶称同尾酶。配伍末端可以相互连接，产生平端的不同的酶切割DNA后，也可以彼此连接。但是以这种方式连接后的DNA片段中，不再含有原来两个同尾酶的酶切位点。如BamH I和Bgl II水解不同的DNA分子，产生相同的黏性末端，连接后的序列不能再被BamH I和Bgl II识别。

（三）影响限制性核酸内切酶活性的因素

1.DNA纯度　在DNA样品中若含有蛋白质，或制备过程所用的样品中没有去除干净乙醇、酚、SDS、EDTA、氯仿和某些高浓度金属离子，均会降低限制性核酸内切酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。

2.限制性核酸内切酶的缓冲液　限制性核酸内切酶的标准缓冲液包括氯化钠、氯化镁或氯化钾、Tris-HCl、巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）以及牛血清白蛋白（BSA）等。使用所有限制酶均可发挥活性的一种缓冲液。不同限制性内切酶对氯化钠盐浓度的要求不同，这是不同限制酶缓冲液组成上的一个主要的不同。据此可分为高盐、中盐和低盐缓冲液，在进行双酶解或多酶解时，若这些酶切割可在同种缓冲液中作用良好，则几种酶可同时酶切；若这些酶所要求的缓冲液有所不同，可采用以下方法进行消化反应：先用要求低盐缓冲液的限制性内切酶消化DNA，然后补足适量的NaCl，再用要求高盐缓冲液的限制酶消化；先用一种酶进行酶解，然后用乙醇沉淀酶解产物，再重悬于另一缓冲液中进行第二次酶解。

3.酶切消化反应的温度　影响限制性内切酶活性的一个重要因素是DNA消化反应的温度。限制性内切酶不同，则各自的最适反应温度也不同。多数限制性内切酶的最适反应温度是37℃，少数限制性内切酶的最适反应温度低于或高于37℃。

4.DNA的分子结构　DNA的分子构型对限制性内切酶的活性有很大影响，如消化超螺旋的DNA比消化线性DNA用酶量要高出许多倍。有些限制性内切酶消化它们自己的处于不同部位的限制位点，效率也有明显差异。而限制性内切酶反应的终止通常是采用65℃条件下温浴5min；加终止反应液（如0.5mol/L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10mol/L）螯合Mg2+，以终止反应。