（一）原理

是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白，先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温浴，以封闭其非特异性位点。然后加入特异性抗体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。

（二）步骤

①用已制备好的SDS-PAGE分离的蛋白凝胶。

②用一张滤纸，剪成与胶同样大小，在转移电泳缓冲液中预湿，放在Scotch-Brit板上，在胶的阴性端放上滤纸，胶的表面用该缓冲液浸湿，排出所有气泡。

③在胶的阳极面放置同样大小浸湿的硝酸纤维素膜，排出气泡，再在滤膜的阳极端放置一张滤纸，排出气泡，再放一个Scotch-Brit板。

④将以上“三明治”样装置放入一个塑料支撑物中间，将支撑物放入电转移装置中，加入电转移缓冲液。

⑤接通电源：使胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电压为14V 4℃转移4h或过夜。(www.daowen.com)

⑥将滤膜放入丽春红S溶液中5min，蛋白染色水中脱色2min，照相，用印度墨水将分子量标准染色，在水中完全脱色。

⑦将滤膜放在塑料袋中，每3张加入5mL封闭缓冲液（1g速溶去脂奶粉溶于100mL PBS中），封闭特异性抗体结合位点，室温1h，摇动，倒出封闭缓冲液。

⑧在封闭缓冲液中稀释第一抗体，加入后室温放置1h，将滤膜转到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，摇动。

⑨在封闭缓冲液中稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，重复步骤⑧。

⑩将滤膜放在100mL新配制的DAB底物溶液中，大约2～3min就可显色，用水冲洗终止反应，照相。

⑪结果分析：分析阳性（显色）条带的分子量大小，而且根据信号（颜色）强弱分析蛋白表达量。

（娜琴）