（一）基本原理与注意事项

Northern印迹杂交（Northern blotting）是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western印记杂交技术。

Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2'-羟基基团。

RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照相，样品胶则进行Northern转印。琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。

（二）操作步骤

1.用RNAZap去除用具表面的RNase酶污染　用RNAZap擦洗梳子、电泳槽、刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。

2.制胶

①称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mL DEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液（需加DEPC水补充蒸发的水分）。

②在通风橱中加入3.6mL的10×Denaturing Gel buffer（变性胶缓冲液），轻轻振荡混匀。注意尽量避免产生气泡。

③将熔胶倒入制胶板中，插上梳子，如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其他方法去除，或将气泡推到胶的边缘。注：胶的厚度不能超过0.5cm。

④胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加1×MOPS Gel Running buffer（MOPS电泳缓冲液）盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。（配制250mL 1×MOPS Gel Running buffer，在电泳过程中补充蒸发的缓冲液。）

3.RNA样品的制备　在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye（甲醛负载染料）和适当的EB（终浓度为10ug/mL）。混匀后，65℃空气浴15min。短暂低速离心后，立即放置于冰上5min。

4.电泳

①将RNA样品小心加到点样孔中。

②在5 V/cm下跑胶（5×14cm）。在电泳过程中，每隔30 min短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴酚蓝（500bp）接近胶的边缘时终止电泳。

③紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴酚蓝到点样孔的距离。注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。

5.转膜

①用3％双氧水浸泡真空转移仪后，用DEPC水冲洗。

②用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用DEPC水冲洗二次。

③连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜（膜的四边应大于塑胶屏孔口5mm），膜在Transfer buffer（转膜缓冲液）浸湿5min后，放置在多孔渗水屏的适当位置。

④盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁。

⑤将胶的多余部分切除，切后的胶四边要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约2mm，以防止漏气。

⑥将胶小心放置在膜的上面，膜与胶之间不能有气泡。

⑦打开真空泵，使压强维持在50～58 mbar；立即将transfer buffer加到胶面和四周。每隔10min在胶面上加1mL transfer buffer，真空转移2h。

⑧转膜后，用镊子夹住膜，于1×MOPS Gel Running buffer中轻轻泡洗10s，去除残余的胶和盐。

⑨用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于UV交联仪中自动交联。

⑩将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。（避免太长的紫外曝光时间）

⑪将膜在-20℃保存。

6.探针的制备

①在1.5mL离心管中配制以下反应液：

模板DNA（25ng）　　　1μL

随机引物　　　2μL

灭菌水　　　11μL

总体积：　　　14μL

②95℃加热3min后，迅速放置于冰上冷却5min。

③在离心管中按下列顺序加入以下溶液：

10×Buffer　　　2.5 μL

dNTP　　　2.5 μL(www.daowen.com)

111 TBq/mmol［α-32P］dCTP　　　5 μL

Exo-free Klenow片段　　　1 μL

④混匀后（25μL），37℃下反应30min。短暂离心，收集溶液到管底。

⑤65℃加热5min使酶失活。

7.探针的纯化及比活性测定

①准备凝胶：将1g凝胶加入30mL的DEPC水中，浸泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。换用新配制的TE（pH7.6）。

②取1mL一次性注射器，去除内芯推杆，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填Sephadex G-50凝胶。

③将注射器放入一支15mL离心管中，注射器把手架在离心管口上。1600g离心4min，凝胶压紧后，补加Sephadex G-50凝胶悬液，重复此步骤直至凝胶柱高度达注射器0.9mL刻度处。

④100μL STE缓冲液洗柱，1600g离心4min。重复3次。

⑤倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的1.5mL离心管置于管中，再将装填了Sephadex G-50凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准1.5mL离心管。

⑥将标记的DNA样品加入25μL STE，取出0.5μL点样于DE8-paper上，其余上样于层析柱上。

⑦1600g离心4min，DNA将流出被收集在去盖的离心管中，而未掺入DNA的dNTP则保留在层析柱中。取0.5μL已纯化的探针点样于DE8-paper.

⑧测比活性（试剂比活要求：106 cpm/mL）。

8.预杂交

①将预杂交液在杂交炉中68℃预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。

②加入适当的ULRAhyb到杂交管中（以100cm2膜面积加入10mL ULRAhyb杂交液），42℃预杂交4h。

9.探针变性

①用10 mM EDTA将探针稀释10倍。

②90℃热处理稀释探针10min后，立即放置于冰上5min。

③短暂离心，将溶液收集到管底。

10.杂交

①加入0.5mL ULTRAhyb到变性的探针中，混匀后，将探针加到预杂交液中。

②42℃杂交过夜（14～24h）。

杂交完后，将杂交液收集起来于-20℃保存。

11.洗膜

①低严紧性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1（100 cm2膜面积加入20mL洗膜溶液），室温下，摇动洗膜5min两次。

②高严紧性洗膜：加入High Stringency Wash Solution#2（100cm2膜面积加入20mL洗膜溶液），42℃摇动洗膜20min两次。

12.曝光

①将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防止膜干燥。

②检查膜上放射性强度，估计曝光时间。

③将X光底片覆盖于膜上，曝光。

④冲洗X光底片，扫描记录结果。

13.去除膜上的探针　将200mL 0.1％SDS（由DEPC水配制）煮沸后，将膜放入，室温下让SDS冷却到室温，取出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存几个月。

（三）优缺点

1.过程较多，耗时较长。

2.Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降。