蛋白质浓度的测定是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法。常用的经典方法包括凯氏定氮法（Kjeldah）、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法等，还有最近新兴的考马斯亮蓝（Bradford）法和二喹啉甲酸法（BCA法）。

这些方法各有千秋，凯氏定氮法操作相对复杂，但结果准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质，但仅以氮含量标定蛋白质的含量也有可能受三聚氰胺等的干扰。双缩脲法虽然灵敏度差，但可用于无需十分精确的蛋白质快速测定。近年来，Bradford法和二喹啉甲酸法（BCA法）由于具有快捷、灵敏度高、干扰因素少等优点，应用越来越广泛。下面对各个方法的原理做简单介绍。

（一）凯氏定氮法

凯氏定氮法的原理为：每100g蛋白质含氮量16g。样品与浓硫酸共热，含氮有机物经消化分解产生氨，氨又与硫酸作用，形成硫酸铵。经强碱碱化使之分解放出氨，通过蒸气将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算样品的氮含量。

为了加速消化，可加入硫酸铜作催化剂，加入硫酸钾以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。

计算所得结果为样品总氮量，如需求得样品中的蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮。如需进一步求得样品中蛋白质的含量，用样品中的蛋白氮乘以6.25即可。

（二）双缩脲法

双缩脲（NH2CONHCONH2）在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键（—CONH—），在碱性溶液中也能与Cu2+反应生成紫红色化合物。还具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或通过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用比色法来测定蛋白质含量。

双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一，操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除了—CONH—有此反应外，—CONH2、—CH2NH2、—CS—NH2等基团也有此反应。

（三）紫外分光光度法

蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸及环状的结构可以产生π→π*跃迁，它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，因而不可作为蛋白质定量测定的依据，但由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要准确定量必须要有待测蛋白质的纯品作为标准来比较，或者已经知道其消光系数作为参考。

三种氨基酸的近紫外吸收带（pH=6），丙氨酸的λmax=275，ε=200；酪氨酸的λmax=275，ε=1300；色氨酸的λmax=275，ε=5000。另外不少杂质在280nm波长下也有一定吸收能力，可能发生干扰，其中尤以核酸（嘌呤和嘧啶碱）的影响最为严重，核酸的最大吸收峰在260nm处，因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定OD260nm和OD280nm，然后根据两种波长的吸光度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推测出蛋白质的真实含量，其公式为：(www.daowen.com)

蛋白质浓度mg/mL=其中：纯的蛋白质=1.75

此种计算方法误差较大，若采用A280/A260的紫外吸收，则精确度大为提高，经多次定量分析比较，正负误差仅为2％左右，计算经验公式为：

蛋白质浓度mg/mL=A260/［27+120（A280/A260）］

本法操作简便迅速，且不消耗样品（可以回收），多用于纯化蛋白质的微量测定。主要缺点：当待测蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸与色氨酸含量差异较大时，则产生一定误差。

（四）考马斯亮蓝染色法

考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性，考马斯亮蓝G250的最大吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰变为595nm。

在一定范围内，考马斯亮蓝蛋白质复合物呈青色，在595nm下，光密度与蛋白质含量成线性关系，可以用于蛋白质含量的测定。此种方法更简单、快捷，灵敏度和准确性更高，目前已广泛应用。

（五）BCA检测法

BCA比色法是依据在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与Cu+形成络合物，并将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA形成稳定的深紫色复合物，于562nm处有最大吸收峰，其强度与蛋白质浓度成正比。此法最大的特点是抗干扰性强，BCA法的灵敏度与Folin-酚法相似。

（六）Folin-酚法

Folin-酚法的显色原理是根据双缩脲反应，蛋白质分子中的肽键（—CONH—）在碱性溶液中与Cu+形成化合物，在Cu+的催化下，磷钼酸被蛋白质中的芳香族氨基酸残基还原，产生深蓝色物质，其最大吸收峰在745～750nm处，在一定浓度范围内，吸光度与蛋白质中色氨酸与酪氨酸含量成正比。Folin-酚试剂可以强化双缩脲反应，提高了灵敏度。通常此法的测定范围在20～250μg，最低检测限度为5μg。