（一）试剂及配制

1.30％丙烯酰胺储存液（ACR∶Bis=29∶1）。

2.10％SDS∶SDS 1g加ddH2O至10mL。

3.10％过硫酸铵：过硫酸铵1g加ddH2O至10mL。

4.TEMED（四甲基乙二胺）。

5.2％溴酚蓝：水溶性钠型溴酚蓝2g加ddH2O至100mL。

6.1.5M Tris-HCl缓冲液（pH8.8）∶Tris17.8g加适量ddH2O溶解，用1M HCl调pH至8.8，加ddH2O定容至100mL。

7.1M Tris-HCl缓冲液（pH6.8）∶Tris12.1g加适量ddH2O溶解，用1M HCl调pH至6.8，加ddH2O定容至100mL。

8.上样缓冲液：甘油2mL，10％SDS 4mL，1M Tris-HCl缓冲液（pH6.8）1mL，2％溴酚蓝2mL，1mg/mLDTT2mL，混匀，分装EP管，4℃冰箱保存。

9.Tris-甘氨酸电泳缓冲液（10×）∶甘氨酸141.1g，Tris30g，SDS10g，ddH2O定容至1000mL调pH至8.3。

（二）操作步骤

1.安装垂直板电泳装置，检查装置是否密封完好。(www.daowen.com)

2.制备SDS聚丙烯酰胺凝胶：先配制分离胶，灌入安装好的垂直板中，立即在胶面上加盖一层双蒸水，静置待凝胶聚合后（约20min）去除水相；再配制浓缩胶，灌入垂直板中至玻璃板顶部0.5cm处，插入梳子，避免混入气泡，静置待胶聚合后，加入电泳缓冲液，拔出梳子。

3.上样：每孔加入20μL样品

4.电泳：接通电泳，将电压调至80V左右。当溴酚蓝进入分离胶后，把电压提高到150V，电泳至溴酚蓝距离胶底部1cm处，停止电泳。得到的电泳条带可以用于后续实验（例如Western Blot的转膜等实验）进行纯度浓度的鉴定。

（三）注意事项

1.SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4g SDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。

2.用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须制作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。并且SDS-PAGE测定分子量存在一定的误差（10﹪）。

3.如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯、样品溶解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

4.APS应该现用现配，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。通常胶在30min～1h内凝。如果凝得太慢，可能是TEMED或APS剂量不够或失效。如果凝得太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。

（四）聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白的回收

电泳得到的目的蛋白需要从凝胶中回收，通过将蛋白条带从PAGE-胶上切下来，经过洗脱可达到回收目的蛋白的目的。洗脱法分为自由洗脱和电洗脱，自由洗脱就是把胶条置于缓冲液中，蛋白质在缓冲液中溶解。电洗脱则需要把胶条置于电场中进行洗脱。目的蛋白洗脱之后经过置换可得到纯的蛋白。